2013 Fiscal Year Annual Research Report
非特異―特異複合体形成の動的構造解析による転写因子のＤＮＡ認識機構の解明
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24770106
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| Research Institution | Suntory Foundation for Life Sciences |
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Principal Investigator |
原田 英里砂 公益財団法人サントリー生命科学財団, その他部局等, 研究員 (70541332)
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| Keywords | NMR / 蛋白質構造 |
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| Research Abstract |
前年度までの研究から、sox2の遊離状態の構造は温度上昇に伴いアンフォールディングしていくので、生体内での環境条件を考慮する必要があることが示された。そのため、蛋白質全体の２次構造の変化をCDで測定し変性中点（Tm）が43度であることを確認した。つまり、37度である生体内の環境では構造をとっていない領域を含む天然変性状態であることが示された。そこで遊離状態における低存在比の構造を観測するため、37度の条件でNMRによる緩和分散法測定を行った。37度ではヘリックス構造が一部存在するのみであり、その部分を含む領域で低存在比の状態が観測された。25度での緩和分散法の結果と組み合わせることで、sox2の３本のヘリックス間における構造の柔軟性の違いを明らかにすることができた。また、構造を保っている２５度の条件下でITC測定によるDNAとの相互作用パラメーター決定を試みたが、配列特異的DNAの滴定においても熱力学的パラメーターが決定できる滴定曲線が得られなかった。これはDNAとの相互作用において特異的結合と非特異的結合が混在しているからだと考えられる。そのため、残基レベルでDNA相互作用を解析することを優先し、NMRによる配列特異的、及び非特異的DNAの滴定実験を行い、配列特異的DNAとの結合においても非特異的結合を伴いながら結合することが分かった。また、in vivo条件を模した環境でのsox2の構造を捉えるため、膜透過性ペプチドを付加した目的蛋白質を動物細胞に導入することで細胞内に存在する蛋白質を直接観測するin-cell NMRの導入を試みた。蛍光観測により、細胞内に導入されるが細胞質内にとどまることはなく核へと移行していく様子を捉えることができた。しかしながら、核に結合した状態のスペクトルを観測するのは難しく、現在は蛋白質導入時間の検討などNMR実験条件の最適化を行っている。
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