2013 Fiscal Year Research-status Report
細胞外分子シャペロンの新たな機能と病原細菌のバイオフィルム形成機構
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24780079
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
杉本 真也 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (60464393)
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| Keywords | 分子シャペロン / バイオフィルム / 細胞外マトリクス / ブドウ球菌 / ClpB / DnaK |
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| Research Abstract |
本研究では細胞外に排出された細胞質分子シャペロンDnaK、ClpBのバイオフィルム形成における役割や作用機序の解明を目指し、以下の点について検討した。
①変異体DnaK発現プラスミドの作製：野生型DnaK発現プラスミドをもとに10種類のDnaK変異体タンパク質を発現するプラスミドを作製し、それらの発現を確認した。今後、全ての変異体タンパク質を精製し、バイオフィルム形成に与える影響を調べる。
②ClpBと相互作用するタンパク質の同定：プルダウンアッセイによりClpBと相互作用する黄色ブドウ球菌細胞表層タンパク質の探索を行った。その結果、Eap（Extracellular adherence protein）が同定された。黄色ブドウ球菌eap欠損株（Δeap）では、野生株に比べてClpBの結合が低下したことから、ClpBはEapを足場として黄色ブドウ球菌の細胞表層に結合する可能性が示された。しかし、ClpBはΔeap株に対しても弱いながら結合することから、他の分子とも相互作用する可能性がある。現在、それらの特定を試みている。
③DnaKおよびClpBの局在解析：蛍光抗体ラベル法により、バイオフィルム内部における細胞外分子シャペロンの分布を明らかにすることが出来た。また、大気圧走査電子顕微鏡を用いた抗体ラベル観察と重金属ラベル観察により、黄色ブドウ球菌のバイオフィルム内部におけるDnaKとClpBの局在と細胞の分布を詳細に調べた。その結果、バイオフィルム底面においてDnaKとClpBが細胞表層に局在することが示された。これらにより、非破壊かつ高い抗原性を保った状態で目的とする細胞外分子シャペロンの挙動の一端を明らかにすることが出来た。
以上の成果の一部は、第5回欧州微生物学会および第10回国際AAAタンパク質会議において発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通り、ClpBが結合する黄色ブドウ球菌の細胞表層分子としてEapを同定することが出来た。また、間接蛍光抗体法および大気圧走査電子顕微鏡を用いた免疫電顕観察により、バイオフィルム内部における細胞外分子シャペロンの局在をマクロなレベルからミクロなレベルまで明らかにすることができた。一方、DnaKの変異体解析については、プラスミドコンストラクションは完了したものの、精製タンパク質を用いた機能解析は完了しなかった。この点については、次年度以降の課題である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、DnaKの変異体解析を継続するとともに、バイオフィルム形成における細胞外分子シャペロンの重要性を黄色ブドウ球菌以外の病原細菌においても検討する。具体的には、緑膿菌とコレラ菌のバイオフィルムモデルを用いる。また、線虫Caenorhabditis elegansバイオフィルム感染モデルを用いて各種バイオフィルム形成細菌の病原性を評価し、DnaKとClpBの重要性を明らかにする。さらに、DnaKとClpBに対する特異的な抗体を用いて、病原性やバイオフィルム形成を制御できるか否かを検証する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当該年度に欧州での国際学会へ参加するため、予定より高額の旅費が必要となることを見越して前倒し支払い請求を行った。しかし、物品費を予定よりも低額に抑えることが出来たため、残額を次年度へ繰り越し、消耗品等に係る物品費として使用することにした。
分子生物学実験試薬や生化学実験試薬、およびプラスチック器具類に必要な物品費として使用する予定である。また、当該研究の成果を発表するための国際学会への参加費（旅費を含む）や論文投稿料・掲載料としての使用を予定している。
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Research Products
(10 results)
