ＰＫＣ―デルタを標的とした増殖硝子体網膜症の治療

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24791862
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Oita University
• Principal Investigator: 横山 勝彦 大分大学, 医学部, 助教 (90464461)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 眼生化学 / 眼分子生物学 / 増殖性硝子体網膜症 / PKC-δ / TGF-β

Research Abstract

TGF-β2によるPKC-δの活性化とPKC-δ阻害剤のI型mRNA及びタンパク発現に対する影響を検討した。培養網膜色素上皮細胞をTGF-β2で刺激するとPKC-δが活性化されることを抗リン酸化PKC-δ抗体を用いたWestern blot法で確認した。I型コラーゲンα2鎖の変動をreal-time RT-PCR法で比較検討したところ、それぞれのｍRNAの発現はPKC-δ阻害剤により抑制された。抗ヒトI型コラーゲン抗体を用いた免疫細胞染色を用いてPKC-δ阻害剤のタンパク産生への影響を検討したところ、TGF-β2添加により増殖したタンパク産生はPKC-δ阻害剤により抑制された。TGF-β2で誘導されるI型コラーゲンα2鎖のプロモーター活性に対するPKC-δ阻害剤の影響を検討した。PKC-δ阻害剤を添加することで転写活性は抑制された。
TGF-β2の主要なシグナル伝達経路はSmad系で、PKC-δとSmadとのクロストークを解析するため、SmadのDNA結合エレメント：（CAGA）を12個連結させたSmad反応性プロモーター：（CAGA）12をルシフェラーゼ遺伝子の上流につないだプラスミド（作成済み）を
用いてSmadの転写活性に対するPKC-δ阻害剤の影響を解析した。ルシフェラーゼ活性の低下はなくPKC-δは培養網膜色素上皮細胞においてSmad非依存的にI型コラーゲンα2鎖のプロモーター活性に関与することが確認された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

H24年度は１）培養網膜色素上皮細胞において、TGF-β2で誘導される線維性コラーゲン（I型およびIII型コラーゲン）の発現が、PKC-δ阻害剤によって抑制できるか否かをI型およびIII型コラーゲンのプロモーター活性やｍRNA発現およびタンパク産生を指標に検討する。２）I型およびIII型コラーゲンのプロモーター領域に結合するTGF-β2関連転写因子を解析し、よりピンポイントな標的因子を同定する、を研究目的として掲げた。
現在、I型コラーゲンにおいてはPKC-δ阻害剤によりｍRNA発現およびタンパク産生、転写活性が抑制されることが確認された。またPKC-δは培養網膜色素上皮細胞においてSmad非依存的にI型コラーゲンα2鎖のプロモーター活性に関与することが確認された。
H24年度の研究目標はまだ達成されていないが、現在III型コラーゲンのおける同様の研究が現在進行中である。

Strategy for Future Research Activity

Smadのリンカー部位のリン酸化に与える影響を各種リン酸化抗体を使用してWestern blot法で確認する。
増殖性硝子体網膜症（PVR）の動物モデルでの、PKC-δ阻害剤の有効性と安全性を検討するためにPVR動物モデルに硝子体手術を行い、術中の眼内還流液にPKC-δ阻害剤を添加し、その有効性と安全性を検討する。同時にPVR形成に関与するmicroRNAを同定する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

動物（ラット）、飼育　400000（円）、光顕標本作成200000（円）、
組織染色に関する試薬　200000（円）、各種阻害剤200000（円）、
遺伝子導入試薬　　　　150000（円）、ピペット、チューブ83500（円）、
western blot 試薬　200000（円）、
24年度はIII型コラーゲンに対するアプローチがまだ進行途中であり、24年度に計上した物品購入が進んでいないため、未使用額が発生した。そのため25年度にIII型コラーゲンに対する研究を繰り越して行うことと、動物モデルに対する研究も合わせて行っていく予定である。