2014 Fiscal Year Annual Research Report
脳内に核酸医薬を送達する高分子ミセルの創製と脳神経系難病の標的治療への展開
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25000006
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
片岡 一則 東京大学, 工学系研究科, 教授 (00130245)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横田 隆徳 東京医科歯科大学, 医歯学総合研究科, 教授 (90231688)
位高 啓史 東京大学, 医学系研究科, 特任准教授 (60292926)
津本 浩平 東京大学, 工学系研究科, 教授 (90271866)
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| Project Period (FY) |
2013-04-26 – 2018-03-31
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| Keywords | 高分子ミセル / 薬物送達システム / 遺伝子治療 / 脳一血液関門 / アルツハイマー病 / siRNA / メッセンジャーRNA / グルコーストランスポーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脳は高度に発達した生体バリア(血液-脳関門 : BBB)に守られているため薬剤の送達が極めて困難な部位である。本研究の目的は、この様な強固な生体バリアを克服して脳神経系に核酸医薬を送達する高分子ミセルを構築し、アルツハイマー病などの脳神経系難治疾患の分子治療における有効性を実証することである。本年度は、これまでに確立したBBBを効率的に通過するグルコース結合型高分子ミセルについて、2光子レーザーを搭載した共焦点顕微鏡を用いて脳深部に至る集積分布を検討した。その結果、脳表から深さ60μmまでの神経細胞の少ない層ではミセルの分布が少なく、より深部の細胞が多い層において多くのミセルが分布している事が明らかになった。またBBB通過が期待できる直径30nmの核酸(pDNA, siRNA)を封入したグルコース結合型高分子ミセルを全身投与し、脳内へ集積している様子が観察された。特にsiRNAを封入したミセルについては、これまでに得られた結果に基づいてミセル表層のグルコース密度を精密に制御する事でBBBを通過し、標的とするニューロンへの取り込みに成功した。一方、mRNAを用いたアルツハイマー病治療の実現に向けて、アミロイド分解酵素であるネプリライシン(NEP)を治療因子として選定し、治療実験を行った。アミロイドβ(Aβ)を投与したマウスの脳室内へ、NEP発現mRNAをミセルに搭載して投与したところ、脳内でのAβ分解が促進され、本システムの治療応用への有用性を示すことに成功した。さらにファージディスプレイにより、ニューロンに取込まれる12個のアミノ酸からなるペプチドを特定することに成功した。以上、各検討項目について、当初の研究計画調書に沿って進捗しているとともに、実験動物内でのAβ分解が促進される等一部は計画を前倒しする形での成果が得られている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
高分子の分子設計からin vitro、in vivoでの機能評価、さらには、動物モデルにおける治療効果の確認へと進む本研究計画の推進においては、検討課題が分子設計・機能評価・展開研究の各グループ内で閉じることなく、密接な連携を通じた研究の進捗が必至である。そこで、緊密な連携体制を構築し、研究を進めた結果、下記の様な特筆すべき成果を得ることが出来た。
1) BBBを通過するグルコース結合型高分子ミセルに関して、機能評価Gが中心となって2光子レーザーを搭載した共焦点顕微鏡を用いて、脳の深部に至るまでミセルが分布している事を明らかにした。
2) pDNA内包ミセルに、分子設計Gが最適化したリガンド密度でグルコースを結合させた高分子ミセルを構築し、全身投与による脳への集積および血管内皮細胞への集積が示唆される結果が得られ、脳内へpDNAを送達することが可能であることが示唆された。
3) 機能性トリブロック共重合体を用いて調製したsiRNA封入高分子ミセルの表層にグルコースリガンドを導入し、全身投与を介して脳実質部へとsiRNAを効率良く集積させることに成功した。
4) 分子設計Gと展開研究Gの連携により、脳組織に対してほとんど毒性を示すことなく、高い効率でmRNAの導入が可能な高分子ミセルの構築に成功し、マウス脳室内へ投与したところ、ADの病因物質を効率的に分解することに成功した。
このように2年目の段階で既に脳神経系難治疾患治療に有効なシステムを構築することに成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
「11. 現在までの達成度」に記述した様に、本研究は当初の計画以上に進展していると自己評価される。したがって、今後の研究については、当初の計画に沿って推進して行く予定である。なお、本年度に研究を遂行する上で生じた問題点については、以下に示す様な対応を行う事によって解決の見通しを得ており、今後の研究計画は予定通りの進捗が見込まれる。
1) グルコース結合型高分子ミセルについては、これまでに効率的にBBBを通過し、脳実質部で一部がニューロンへ取込まれることを明らかにしているが、一方で大部分は細胞へ取込まれずに脳実質液中に存在する。そこでBBB通過を志向したグルコースリガンドに加えて、脳実質内でより選択的な細胞取り込み能を賦与するために、2ndリガンドを結合したデュアルリガンド結合型高分子ミセルの構築を開始する。具体的には、本年度にファージディスプレイにより探索した12個のアミノ酸からなるペプチドに加え、低分子のアミノ酸、抗体フラグメントを2ndリガンドの候補とする。
2) pDNA封入ミセルについては、これまでに得られた知見を活かし、ミセル表層のグルコース密度の最適化を行い、脳内のどこまで到達しているのか、遺伝子発現するのかをIn vivo共焦点顕微鏡や免疫染色した組織切片観察などを行い評価する。
3) 上述のように、グルコースリガンド密度が最適化されたsiRNA封入高分子ミセルにより、BBBを通過しsiRNAを高効率に脳実質部、特にニューロンへと送達することに成功した。そこで今後は、ニューロンにおけるsiRNAの活性(遺伝子発現抑制効果)に関しても評価を行う。具体的には、アルツハイマー病の病因物質の1つであるβ-セクレターゼの遺伝子抑制を標的とする。また、脳実質部におけるsiRNAの動態を制御するために、分子設計Gで開発する2ndリガンドを搭載したsiRNA封入高分子ミセルの開発にも着手する。
4) 前年度までにmRNAを用いて抗Aβ単鎖抗体をほ乳類細胞から高効率に分泌できるシステムを確立したことから、今後動物実験においてその治療への有効性を検証する。また、その生体内での作用メカニズムに関しても詳細な解析も行う。また、既に高分子ミセルを用いることで、脳内へ効率的にmRNAを導入出来ることを示してきたが、分子設計Gと展開研究Gの連携により高分子ミセルの更なる高機能化を目指した開発を進める。
5) 前年度までにアルツハイマー病を標的とした核酸医薬を封入した高分子ミセルシステムの一部が確立された。そこで今後は展開研究Gが中心となって、これらのミセルを用いたモデルマウスの治療効果について検討する。具体的にはまずアルツハイマー病モデルマウス(APP/PS1マウス)を準備し、本年度後期に導入した水迷路等を用いて行動試験を行い、記憶や学習といった「能力」に関する検討を行なう。
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[Journal Article] A tadpole-shaped gene carrier with distinct phase segregation in a ternary polymeric micelle2015
Author(s)
Q. Chen, K. Osada, M. Pennisi, S. Uchida, T.A. Tockary, A. Dirisala, Y. Li, K.M. Takeda, S. Oniyanagi, K. Itaka, K. Kataoka
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Journal Title
Soft Matter
Volume: 11
Pages: 2718-2722
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Precise engineering of siRNA delivery vehicles to tumors using polyion complexes and gold nanoparticles2014
Author(s)
H.-J. Kim, H. Takemoto, Y. Yi, M. Zheng, Y. Maeda, H. Chaya, K. Hayashi, P. Mi, F. Pittella, R.J. Christie, K. Toh, Y. Matsumoto, N. Nishiyama, K. Miyata, K. Kataoka
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Journal Title
ACS Nano
Volume: 8
Pages: 8979-8991
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Actively-targeted polyion complex micelles stabilized by cholesterol and disulfide cross-linking for systemic delivery of siRNA to solid tumors2014
Author(s)
Y. Oe, R.J. Christie, M. Naito, S.A. Low, S. Fukushima, K. Toh, Y. Miura, Y. Matsumoto, N. Nishiyama, K. Miyata, K. Kataoka
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Journal Title
Biomaterials
Volume: 35
Pages: 7887-7895
DOI
Peer Reviewed
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[Patent(Industrial Property Rights)] 薬剤送達用のキャリア、コンジュゲートおよびこれらを含んでなる組成物並びにこれらの投与方法2014
Inventor(s)
片岡一則, 安楽泰孝, 西山伸宏, 宮田完二郎, 石井武彦, 松本有, 福里優, 溝口明祐, 横田隆徳, 桑原宏哉, 仁科一隆, 水澤英洋
Industrial Property Rights Holder
国立大学法人東京大学、国立大学法人東京医科歯科大学
Industrial Property Rights Type
特許
Industrial Property Number
特願2014-096935
Filing Date
2014-05-08
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