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2013 Fiscal Year Annual Research Report

シナプスにおける逆行性シグナルが生後発進期の機能的神経回路形成に果たす役割の解明

Research Project

Project/Area Number 25000015
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

狩野 方伸  東京大学, 医学系研究科, 教授 (40185963)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 崎村 健司  新潟大学, 脳研究所, 教授 (40162325)
少作 隆子  金沢大学, 保健学系, 教授 (60179025)
橋本 浩一  広島大学, 医歯薬保健学研究科, 教授 (00303272)
Project Period (FY) 2013-04-26 – 2018-03-31
Keywordsシナプス / シナプス刈り込み / 生後発達 / 神経回路 / 逆行性シグナル / 小脳 / 登上線維 / マウス
Research Abstract

(1)約300種類の逆行性シグナル関連候補遺伝子のうち、プルキンエ細胞で高い発現を示す60種類のスクリーニングを終了した。延髄と小脳の共培養系において、ノックダウン(KD)ベクターを用いて、プルキンエ細胞特異的に標的分子をmicroRNAによりKDし、共培養開始後15-18日において登上線維刺激によるシナプス電流をプルキンエ細胞から記録し、シナプス刈り込みに影響を与える分子として4個を同定した。(2)この4分子について、生後2日のマウス小脳にKDベクターを注入し、プルキンエ細胞特異的に標的分子のKDとGFP発現を生じさせた。生後8-11日、生後12-14日、生後22-30日に小脳スライスを作製し、標的分子がKDされたプルキンエ細胞(GFP陽性)と正常プルキンエ細胞(GFP陰性)から記録をして、電気生理学的に登上線維の支配パターンを調べた。その結果、Sema3AのKDでシナプス刈り込みの促進が、Sema7AのKDでは刈り込みの阻害がみられた。また、細胞認識分子であるneuroligin 2のノックアウト(KO)マウスにおいて、後期刈り込みに障害をみとめた。また、分泌性細胞認識分子のプルキンエ細胞特異的KOマウス作製を開始した。(3)Seina3Aの受容体Plexin A4、及びSema7Aの受容体Plexin C1またはIntegrin B1のmRNAが登上線維の起始核である下オリーブ核に強く発現することを確認した。これらを登上線維でKDするために、生後2日のマウス延髄の下オリーブ核にKDベクターを注入し、生後12-14日および生後22-30日に電気生理学的解析を行った。Plexin A4およびPlexin C1/Integrin B1のKDの効果はSema3A及びSema7AのKDと同じであった。(4)麻酔下のマウス小脳に膜透過性のCa(2+)指示薬OGB-1を注入して多数のプルキンエ細胞に取り込ませ、2光子顕微鏡による多細胞同時Ca(2+)メージングにより、登上線維活動を計測した。野生型マウスの生後発進を解析するとともに、新たなCa(2+)指示薬Cal-520の性能評価を行った。(5)内因性カンナビノイド(2-アラキドノイルグリセロール : 2-AG)の合成酵素DGLαと受容体CB1のKOマウスの小脳登上線維シナプスの刈り込みを調べたが、顕著な異常はなかった。また、側坐核の電気生理学的解析から、DGL α KOマウスでは興奮性シ十プスにおいてGluN2Bを含むNMDA受容体機能が低下していることを見出した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

平成25年度の交付申請書に記載した研究計画については、殆どの項目において達成し、ほぼ満足できる結果を得られた。中には、当初の予想をはるかに超えて進展しているものもある。特に、1. プルキンエ細胞発現分子の網羅的スクリーニングと候補分子の絞り込みは、約300種類の逆行性シグナル関連候補遺伝子のうち、プルキンエ細胞で高い発現を示す60種類のスクリーニングを終了している。この実験は、プルキンエ細胞に強い発現を示すものを優先的に行っており、一般的に発現レベルの低いものはpositiveな結果が得られる見込みが低いことを考慮すると、実質的には、スクリーニングを7割程度終了したと言える。これを踏まえて、2. プルキンエ細胞に存在する候補分子のin vivo実験系による解析もきわめて順調に進み、Sema3AとSema7Aがシナプス刈り込みを制御する逆行性シグナル伝達分子であることを明らかにした。さらに、3. 登上繊維に発現する分子の解析において、Sema3AとSema7Aが、登上線維に発現するそれぞれの受容体に作用してシナプス刈り込みを制御することを見出した。これらの成果は論文にまとめ、現在revisionの段階に来ている。一方、当初平成25年度に予定していた下オリーブ核に発現する候補分子のプロファイリングであるが、これに必要な下オリーブ核でGFPを発現するトランスジェニックマウスの精子を購入しようとした。しかし、提供先から精子の状態が悪く、再作成する必要があるとの連絡を受け、平成26年1月にようやく入手できたが、平成25年度中のプロファイリングが実施不可能となり、5ヶ月延長変更し平成26年度に計画を遂行せざるを得ななった。しかしながら、全体としてみれば、当初の計画以上に進展していると考えることができる。

Strategy for Future Research Activity

1. プルキンエ細胞発現分子の網羅的スクリーニングと候補分子の絞り込み :
2. プルキンエ細胞に存在する候補分子のin vivo実験系における登上線維シナプス刈り込みへの関与の解析 : 現在、in vivoでのスクリーニング系の効率が格段に進歩しているので、今後は、in vitroの共培養標本を用いることなく、直接in vivoの実験系でスクリーニングを進める。プルキンエ細胞での発現レベルが高いものを中心に候補遺伝子のスクリーニングを平成26年度にほぼ終了する。シナプス刈り込みに関与する分子に関して、in situ hybrydyzationや免疫染色による発現解析を行う。(狩野担当)。既存のKOマウスの解析を平成29年度まで継続する(橋本担当)。平成25年度に作製を開始した分泌性細胞認識分子のプルキンエ細胞特異的KOマウスをはじめとして、新たに作製した逆行性シグナル関連分子のKOマウスの解析を行う。(狩野、橋本担当)。新たに同定した逆行性シグナル関連分子のうち、既存のKOマウスが入手できないものや、部位特異的KOマウスの作製が必要なものを新たに作製する(崎村担当)。これらは、いずれも平成29年度まで継続する。
3. 登上線維に存在する候補分子のシナプス刈り込みへの関与の解析 : 平成25年度に引き続き、下オリーブ核細胞にmRNAが発現する分子のプロファイリングを行う。候補分子を下オリーブ核においてKDし、発達期の登上線維シナプスに与える影響を電気生理学的に解析する。平成29年度まで継続する。(狩野担当)。既存のノックアウトマウスを解析するとともに(橋本担当)、必要に応じて、新たにKOマウスを作製する(崎村担当)。これらは平成29年度まで継続する。
4. バーグマングリアに発現する候補分子の登上線維シナプス刈り込みへの関与の解析 : 平成26年度に、バーグマングリアに発現する候補遺伝子のプロファイリングを行い(狩野担当)、平成27年度から登上線維シナプス刈り込みの解析を開始し、平成29年度まで継続する(狩野、橋本担当)。必要に応じて、新たにKOマウスを作製する(崎村担当)。平成29年度まで継続する。
5. 登上線維の挙動のリアルタイム解析 : 2光子顕微鏡によりin vivoで登上線維の挙動を観察する。平成26年度に野生型マウスで条件検討し、平成27~29年度にKDまたはKOマウスを解析する(狩野担当)。
6. 小脳神経回路の動作の解析 : 登上線維シナプス刈り込みに異常があるKDまたはKOマウスにおいて、in vivoでプルキンエ細胞集団のCa(2+)メージングにより登上線維活動の時空間パターンを計測し、刈り込み異常がin vivoの神経回路機能に影響するかを調べる。平成29年度まで継続する(狩野担当)。
7. 大脳バレル皮質の受容野マップ形成の解析 : 平成27年度から29年度まで実施する。
小脳においてシナプス刈り込みに関わることが判明した分子のうち、代表的な分子のKDが、大脳バレル皮質のシナプス機能と受容野マップ形成に果たす役割を調べる(狩野担当)。
8. 内因性カンナビノイドによる逆行性シナプス伝達の機能的神経回路形成における役割 : DGLαとCB1のKOマウスを中心に、内因性カンナビノイド系がシナプス伝達と機能的神経回路発達に果たす役割を、海馬と大脳バレル皮質を中心に解析する(狩野、少作担当)。平成29年度まで継続する。

  • Research Products

    (33 results)

All 2014 2013

All Journal Article (14 results) (of which Peer Reviewed: 14 results) Presentation (19 results)

  • [Journal Article] Heterogeneous presynaptic distribution of monoacylglycerol lipase, a multipotent regulator of nociceptive circuits in the mouse spinal cord.2014

    • Author(s)
      Horváth E, Woodhams SG, Nyilas R, Henstridge CM, Kano M, Sakimura K, Watanabe M, Katona I
    • Journal Title

      Eur J Neurosci

      Volume: 39 Pages: 419-434

    • DOI

      10.1111/ejn.12470

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo.2014

    • Author(s)
      Tada M, Takeuchi A, Hashizume M, Kitamura K, Kano M
    • Journal Title

      Eur J Neurosci

      Volume: (in press)

    • DOI

      10.1111/ejn.12476

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The synaptic targeting of mG1uR1 by its carboxyl-terminal domain is crucial for cerebellar function.2014

    • Author(s)
      Ohtani Y, Hiyata M, Hashimoto K, Tabata T, Kishimoto K, Fukaya M, Kase D, Kassai H, Nakao K, Hirata T, Watanabe M, Kano M, Aiba A
    • Journal Title

      J Neurosci

      Volume: 34 Pages: 2702-2712

    • DOI

      10.1523/JNEUROSCI.3542-13.2014

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Endocannabinoid-mediated retrograde modulation of synaptic transmission.2014

    • Author(s)
      Ohno-Shosaku T, Kano M
    • Journal Title

      Curr Opin Neurobiol

      Volume: 29 Pages: 1-8

    • DOI

      10.1016/j.conb.2014.03.017.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Nonlinear decoding and asymmetric representation of neuronal input information by CaMKIIα and calcineurin.2013

    • Author(s)
      Fujii H, Inoue M, Okuno H, Sano Y, Takemoto-Kimura S, Kitamura K, Kano M, Bito H
    • Journal Title

      Cell Reports

      Volume: 3 Pages: 978-987

    • DOI

      10.1016/j.celrep.2013.03.033

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Protocadherin 17 regulates presynaptic assembly in topographic cortico-basal ganglia circuits.2013

    • Author(s)
      Hoshina N, Tanimura A, Yamasaki M, Inoue T, Fukabori R, Kuroda T, Yokoyama K, Tezuka T, Sagara H, Hirano S, Kiyonari H, Takada M, Kobayashi K, Watanabe M, Kano M, Nakazawa T, Yamamoto T
    • Journal Title

      Neuron

      Volume: 78 Pages: 839-854

    • DOI

      10.1016/j.neuron.2013.03.031

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Arc/Arg3.1 is a postsynaptic mediator of activity-dependent synapse elimination in the developing cerebellum.2013

    • Author(s)
      Mikuni T, Uesaka N, Okuno H, Hirai H, Deisseroth K, Bito H, Kano M
    • Journal Title

      Neuron

      Volume: 78 Pages: 1024-1035

    • DOI

      10.1016/j.neuron.2013.04.036

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Diacylglycerol lipase α manipulation reveals developmental roles for intercellular endocannabinoid signaling.2013

    • Author(s)
      Keimpema, E, Alpar A, Howell F, Malenczyk K, Hobbs C, Hurd Y. L, Watanabe M, Sakimura K, Kano M, Doherty P, Harkany T
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 3 Pages: 2-093

    • DOI

      10.1038/srep02093

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Functional labeling of neurons and their projections using a synthetic activity-dependent promoter E-SARE.2013

    • Author(s)
      Kawashima T, Kitamura K, Suzuki K, Nonaka M, Kamijo S, Takemoto-Kimura S, Kano M, Okuno H, Ohki K, Bito H
    • Journal Title

      Nat Methods

      Volume: 10 Pages: 889-895

    • DOI

      10.1038/nmeth.2559

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Acute inhibition of diacylglycerol lipase blocks endocannabinoid-mediated retrograde synaptic suppression : evidence for on-demand biosynthesis of 2-arachidonoylglycerol.2013

    • Author(s)
      Hashimotodani Y, Ohno-Shosaku T, Tanimura A, Kita Y, Sano Y, Shimizu T, Di Marzo V, Kano M
    • Journal Title

      J Physiol (Lond)

      Volume: 591 Pages: 4765-4776

    • DOI

      10.1113/jphysiol.2013.254474

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Disruption of cerebellar microzonal organization in GluD2 (GluRδ 2) knockout mouse.2013

    • Author(s)
      Hashizume M, Miyazaki T, Sakimura K, Watanabe M, Kitamura K and Kano M
    • Journal Title

      Front Neural Circuits

      Volume: 7 Pages: 130

    • DOI

      10.3389/fncir.2013.00130

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Spike timing-dependent selective strengthening of single climbing fiber inputs to Purkinje cells during cerebellar development.2013

    • Author(s)
      Kawamura Y, Nakayama H, Hashimoto K, Sakimura K, Kitamura K, Kano M
    • Journal Title

      Nat Commun

      Volume: 4 Pages: 2,732

    • DOI

      10.1038/ncomms3732

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Functional cooperation of metabotropic adenosine and glutamate receptors regulates postsynaptic plasticity in the cerebellum.2013

    • Author(s)
      Kamikubo Y, Shimomura T, Fujita Y, Tabata T, Kashiyama T, Sakurai T, Fukurotani K, Kano M
    • Journal Title

      J Neurosci

      Volume: 33 Pages: 18661-1867

    • DOI

      10.1523/JNEUROSCI.5567-12.2013

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Synapse elimination in the developing cerebellum.2013

    • Author(s)
      Hashimoto K, Kano M.
    • Journal Title

      Cell Mol Life Sci

      Volume: 24 Pages: 4667-4680

    • DOI

      10.1007/s00018-013-1405-2

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 内因性カンナビノイドは歯状回内分子層の興奮性シナプス入力を抑制し発作を軽減する2014

    • Author(s)
      菅谷佑樹, 山崎真弥, 﨑村建司, 狩野方伸
    • Organizer
      日本生理学会大会
    • Place of Presentation
      鹿児島大学郡元キャンパス(鹿児島県鹿児島市)
    • Year and Date
      2014-03-18
  • [Presentation] 逆行性シグナルをになう内因性カンナビノイド、2-アラキドノイルグリセロールはジアシルグリセロールリパーゼαによってオンデマンドに産生される2014

    • Author(s)
      橋本谷祐輝, 少作隆子, 狩野方伸
    • Organizer
      日本生理学会大会
    • Place of Presentation
      鹿児島大学郡元キャンパス(鹿児島県鹿児島市)
    • Year and Date
      2014-03-18
  • [Presentation] 発達期小脳シナプス刈り込みにプルキンエ細胞由来BDNFが寄与している2014

    • Author(s)
      秋明貞, 宮崎太輔, 山崎真弥, 谷村あさみ, 上阪直史, 渡辺雅彦, 﨑村建司, 狩野方伸
    • Organizer
      日本生理学会大会
    • Place of Presentation
      鹿児島大学郡元キャンパス(鹿児島県鹿児島市)
    • Year and Date
      2014-03-18
  • [Presentation] シナプス刈り込みにおける逆行性シグナルの役割2014

    • Author(s)
      上阪直史, 内ヶ島基政, 三國貴康, 平井宏和, 渡辺雅彦, 狩野方伸
    • Organizer
      日本生理学会大会
    • Place of Presentation
      鹿児島大学郡元キャンパス(鹿児島県鹿児島市)
    • Year and Date
      2014-03-16
  • [Presentation] An autism-associated neuroligin-3 mutation impairs developmental synapse elimination in the cerebellum2013

    • Author(s)
      Lai E, Nakayama H, Nakazawa T, Tabuchi K, Hashimoto K, Kano M
    • Organizer
      Society for Neuroscience
    • Place of Presentation
      San Diego Convention Center (San Diego, California, アメリカ)
    • Year and Date
      2013-11-13
  • [Presentation] Fine scale correspondence between the cerebellar microzones and the aldolase C compartments in mice2013

    • Author(s)
      Tsutsumi S, Yamazaki M, Sakimura K, Kitamura K, Kano M
    • Organizer
      Society for Neuroscience
    • Place of Presentation
      San Diego Convention Center (San Diego, California, アメリカ)
    • Year and Date
      2013-11-12
  • [Presentation] Impairment of cerebellar microzonal organization by aberrant climbing fiber to Purkinje cell wiring in GluRδ2 (GluD2) knockout mouse2013

    • Author(s)
      Miki H, Miyazaki T, Sakimura K, Watanabe M, Kitamura K, Kano M
    • Organizer
      Society for Neuroscience
    • Place of Presentation
      San Diego Convention Center (San Diego, California, アメリカ)
    • Year and Date
      2013-11-12
  • [Presentation] Selective strengthening of single climbing fiber inputs to Purkinje cell sduring postnatal cerebellar development In vivo2013

    • Author(s)
      Kawamura Y, Nakayama H, Hashimoto K, Sakimura K, Kitamura K, Kano M
    • Organizer
      Society for Neuroscience
    • Place of Presentation
      San Diego Convention Center (San Diego, California, アメリカ)
    • Year and Date
      2013-11-11
  • [Presentation] Global sealing-down of excitatory postsynaptic responses in cerebellar Purkinje cells specifically impairs the late phase of climbing fiber synapse elimination during postnatal development2013

    • Author(s)
      Kawata S, Miyazaki T, Yamazaki M, Mikuni T, Yamasaki M, Hahimoto K, Watanabe M, Sakimura K, Kano M
    • Organizer
      Society for Neuroscience
    • Place of Presentation
      San Diego Convention Center (San Diego, California, アメリカ)
    • Year and Date
      2013-11-11
  • [Presentation] Identification of retrograde signaling molecules required for developmental synapse elimination in the cerebellum by an RNAi-based approach2013

    • Author(s)
      Uesaka N, Mikuni T, Hirai H, Kano M
    • Organizer
      Society for Neuroscience
    • Place of Presentation
      San Diego ConventionCenter (San Diego, California, アメリカ)
    • Year and Date
      2013-11-11
  • [Presentation] Nonlinear decoding and asymmetric representation of neuronal input information by CaMKIIα and calcineur2013

    • Author(s)
      Fujii H, Inoue M, Okuno H, Sano Y, Takemoto-Kimura S, Kitamura K, Kano M, Bito H
    • Organizer
      Society for Neuroscience
    • Place of Presentation
      San Diego Convention Center (San Diego, California, アメリカ)
    • Year and Date
      2013-11-10
  • [Presentation] Postnatal desynchronization of climbing fiber responses in Purkinje cell populations of the developing cerebellum2013

    • Author(s)
      Good J-M, Miyazaki T, Kitamura T, Watanabe M, Ssakimura K, Kano M
    • Organizer
      Society for Neuroscience
    • Place of Presentation
      San Diego Convention Center (San Diego, Caifornia, アメリカ)
    • Year and Date
      2013-11-09
  • [Presentation] マウスバレル野第2/3層におけるスパースで不均一な感覚シナプス入力分布2013

    • Author(s)
      喜多村和郎, 狩野方伸
    • Organizer
      日本神経科学大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都府京都市)
    • Year and Date
      2013-06-22
  • [Presentation] サルにおける瞬目反射条件づけ : 筋電位測定法と高速イメージング法を用いた瞬目反射条件づけ方法の開発とその評価2013

    • Author(s)
      桐野豊, 山本茂幸, 鈴木一隆, 豊田晴義, 狩野方伸, 塚田秀夫
    • Organizer
      日本神経科学大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都府京都市)
    • Year and Date
      2013-06-22
  • [Presentation] Endocannnabinoid-Mediated Modulation of Inhibitory Synaptic Transmission to GABAergic and non-GABAergic Neurons in the Bed Nucleus of the Stria Terminal is (BNST)2013

    • Author(s)
      Kato A, Yanagawa Y, Kano M
    • Organizer
      日本神経科学大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都府京都市)
    • Year and Date
      2013-06-21
  • [Presentation] stargazin (TARP γ-2)の欠損による小脳プルキンエ細胞でのカルシウムシグナルの減弱により登上繊維刈り込みの後期過程が選択的に障害される2013

    • Author(s)
      川田慎也, 橋本浩一, 三國貴康, 山崎真弥, 宮崎太輔, 山崎美和子, 渡辺雅彦, 﨑村建司, 狩野方伸
    • Organizer
      日本神経科学大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都府京都市)
    • Year and Date
      2013-06-21
  • [Presentation] 内因性カンナビノイド2アラキドノイルグリセロールは歯状回の興奮性シナプス伝達を抑制し発作を抑制する2013

    • Author(s)
      菅谷佑樹, 山崎真弥, 﨑村建司, 狩野方伸
    • Organizer
      日本神経科学大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都府京都市)
    • Year and Date
      2013-06-21
  • [Presentation] マウス小脳皮質におけるaldolase C発現領域に相関した同期生の高い登上繊維応答2013

    • Author(s)
      堤新一郎, 多田真弓, 崎村建司, 喜多村和郎, 狩野方伸
    • Organizer
      日本神経科学大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都府京都市)
    • Year and Date
      2013-06-20
  • [Presentation] モノアシルグリセロールリパーゼ欠損マウスにおける海馬依存症記憶機能の包括的評価2013

    • Author(s)
      岸本泰司, Barbara Cagniard, 山崎真弥, 中山順子, 﨑村建司, 桐野豊, 狩野方伸
    • Organizer
      日本神経科学大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都府京都市)
    • Year and Date
      2013-06-20

URL: 

Published: 2015-07-15  

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