蛋白質相互作用におけるパターン認識のモレキュラーダイナミクス

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25220205
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 浜窪 隆雄 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (90198797)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堀内 恵子 東京大学, 先端科学技術研究センター, 助教 (00456203) ; 太期 健二 東京大学, 先端科学技術研究センター, 特任助教 (20466866) ; 川村 猛 東京大学, アイソトープ総合センター, 准教授 (70306835) ; 篠田 恵子 東京大学, 先端科学技術研究センター, 特任助教 (80646951) ; 津本 浩平 東京大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (90271866)
• Project Period (FY): 2013-05-31 – 2018-03-31
• Keywords: スプライシング / 自然免疫 / タンパク質相互作用 / 分子認識 / コンピュータシミュレーション

Outline of Annual Research Achievements

ⅰ）PTX3の分子認識機構と自然免疫
PTX3は重症感染症などにおいて放出される細胞外ヒストンの内皮細胞障害活性を凝集反応により保護する効果があることを前年サイエンスシグナリング誌に報告したが、本年度は、ヒストンとPTX3について、反応部位を特定するため、部分長ペプチドを用いて、凝集反応、HUVEC障害活性の両者で調べたところ、PTX3のN端に近い部分のペプチドが重要であることが判明した。ヒストンH3についてもHUVEC障害活性はC端に近い３０アミノ酸残基が重要であることを同定した。取得したヒトH3に対する抗体で、C端を認識するクローンはHUVEC障害活性を阻害したが、PTX3との凝集反応は阻害しなかった。これに対して、PTX3の抗体についてヒストンとの凝集反応について解析したところ、一部のクローンで凝集反応を阻害するものがみつかった。PTX3の診断・治療へのターゲット疾患として血管炎は重要であると考えられ、日本で年間１万人以上がり患し、原因不明の川崎病について、PTX3との関連を探る研究を、愛知医科大小児科と共同研究を行い、血中PTX3濃度と川崎病重症度の相関が高いことが判明したため学会発表を行い、現在論文投稿中である。ヒストンの細胞障害活性に関して昨年度見出したマイクロベジクル放出現象に関して、MS解析等を行い、マーカーとなるタンパク質を同定した。
ⅱ）RNAプロセッシングと細胞周期および細胞分化とのかかわり
大腸菌発現系と別途にHEK細胞発現系を構築した。両者とも精製タンパク質は多量体を形成するが、後者の精製タンパク質で、結合低分子の候補が数個得られた。これらの低分子化合物が阻害剤として作用するかどうかのアッセイ系をスプライシングターゲット遺伝子によるPCRにより立ち上げた。同定した数個のスプライシングターゲット遺伝子に関するデータを取得し、論文投稿準備にはいった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでの成果について、インパクトの高いジャーナルへの投稿することができたが、本研究の主題である分子認識メカニズムについての研究では、PTX3-ヒストンについては凝集反応であること、WTAPについては期待よりタンパク精製が困難であったことなどにより遅れが発生した。しかし本年度、凝集を阻害する抗体候補の取得、WTAP結合化合物のヒットなどのブレークスルーがあり、研究期間内に一定の成果を見込めるものと考える。

Strategy for Future Research Activity

１）PTX3の分子認識機構と自然免疫
これまでに、PTX3とヒストンH3との凝集反応（およびHUVEC細胞障害）について、両者ともほぼ３０アミノ酸残基程度に絞り込むことができた。また、凝集反応を阻害する抗PTX3抗体を取得したことから、本抗体を用いて、PTX3ペプチドと抗体との反応解析を行う。これまでに開発してきたFvモデリング技術により、ペプチドとCDR部位との相互作用について、MDシミュレーションを行い、反応面の解析を行う。抗PTX3抗体を免疫源としてイディオタイプ抗体を取得する。PTX3反応部位を２０アミノ酸程度まで絞り込み、結晶構造解析を行う。ヒストン抗体が取得できた場合も同様に行う。細胞外ヒストンのHUVEC障害時に放出されるマイクロベジクルについて、MS解析により同定した膜蛋白質に対する抗体を用いて特異的FACSを立ち上げる。川崎病患者血清を用いてPTX3複合体解析を行い、分子病態を調べる。また、確立した腹腔臓器手術後の癒着モデルマウスでPTX3ノックアウトマウスにより創傷治癒と癒着の関連を調べる。
２）ＲＮＡプロセッシングと細胞周期および細胞分化とのかかわり
WTAPがオルタナティブスプライシングに関わる分子機構の解明をめざして進めるが、戦略として阻害剤の探索にフォーカスする。確立した発現系で良好な精製タンパク質が得られる断片を用いて、候補化合物のSPRによるスクリーニングを行う。同時に、HUVECおよびHeLa細胞に添加した際の、WTAP複合体の変化をco-IPにより、スプライシングの変化を他ゲット遺伝子のqPCRにより、細胞周期の変化をFACSにて、観察する。また、これまでに同定しているCBLL1のRINGフィンガーについては、タンパク質の精製により、相互作用解析を行う。RNAとの結合については、RIP-PCRにてチェックする。これらにより、結合阻害のサイトを特定する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Mount Sinai School of Medicine(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: Mount Sinai School of Medicine
• [Int'l Joint Research] Eotvos Lorand University(ハンガリー)
  • Country Name: HUNGARY
  • Counterpart Institution: Eotvos Lorand University
• [Journal Article] Kinetic exclusion assay of monoclonal antibody affinity to the membrane protein Robo1 displayed on baculovirus. (2016)
  • Author(s): Kusano-Arai O, Fukuda R, Kamiya W, Iwanari H, Hamakubo T.
  • Journal Title: Anal Biochem. Volume: Apr 16 Pages: 30027-6
  • DOI: 10.1016/j.ab.2016.04.004.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Physiological levels of pentraxin 3 and albumin attenuate vascular endothelial cell damage induced by histone H3 in vitro. (2016)
  • Author(s): Iba T, Hamakubo T, Nagaoka I, Sato K, Jecko T.
  • Journal Title: Microcirculation. Volume: Apr;23(3) Pages: 240-7
  • DOI: doi: 10.1111/micc.12269.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Suppression of Slit2/Robo1 mediated HUVEC migration by Robo4. (2016)
  • Author(s): Enomoto S , Mitsui K , Kawamura T , Iwanari H , Daigo K , Horiuchi K , Minami T , Kodama T , Hamakubo T.
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications. Volume: Jan 22;469(4) Pages: 797-802
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.12.075.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] High avidity chimeric monoclonal antibodies against the extracellular domains of human aquaporin-4 competing with the neuromyelitis optica autoantibody, NMO-IgG. (2016)
  • Author(s): Miyazaki-Komine K, Takai Y, Huang P, Kusano-Arai O, Iwanari H, Misu T, Koda K, Mitomo K, Sakihama T, Toyama Y, Fujihara K, Hamakubo T, Yasui M, Abe Y.
  • Journal Title: Br J Pharmacol. Volume: Jan;173(1) Pages: 103-14
  • DOI: 10.1111/bph.13340.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Severely exacerbated neuromyelitis optica rat model with extensive astrocytopathy by high affinity anti-aquaporin-4 monoclonal antibody. (2015)
  • Author(s): Kurosawa K , Misu T , Takai Y , Sato DK , Takahashi T , Abe Y , Iwanari H , Ogawa R , Nakashima I , Fujihara K , Hamakubo T , Yasui M , Aoki M.
  • Journal Title: Acta Neuropathol Commun. Volume: Dec 4;3(1) Pages: 82
  • DOI: 10.1186/s40478-015-0259-2.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Crystal structure of the anion exchanger domain of human erythrocyte band 3. (2015)
  • Author(s): Arakawa T , Kobayashi-Yurugi T , Alguel Y , Iwanari H , Hatae H , Iwata M , Abe Y , Hino T , Ikeda-Suno C , Kuma H , Kang D , Murata T , Hamakubo T , Cameron AD , Kobayashi T , Hamasaki N , Iwata S.
  • Journal Title: Science. Volume: Nov 6;350(6261) Pages: 680-4
  • DOI: 10.1126/science.aaa4335.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Copper Transport Protein Antioxidant-1 Promotes Inflammatory Neovascularization via Chaperone and Transcription Factor Function. (2015)
  • Author(s): Chen GF , Sudhahar V , Youn SW , Das A , Cho J , Kamiya T , Urao N , McKinney RD , Surenkhuu B , Hamakubo T , Iwanari H , Li S , Christman JW , Shantikumar S , Angelini GD , Emanueli C , Ushio-Fukai M , Fukai T.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: Oct 6;5 Pages: 14780
  • DOI: 10.1038/srep14780.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structure and mechanism of the mammalian fructose transporter GLUT5. (2015)
  • Author(s): Nomura N, Verdon G, Kang HJ, Shimamura T, Nomura Y, Sonoda Y, Hussien SA, Qureshi AA, Coincon M, Sato Y, Abe H, Nakada-Nakura Y, Hino T, Arakawa T, Kusano-Arai O, Iwanari H, Murata T, Kobayashi T, Hamakubo T, Kasahara M, Iwata S, Drew D.
  • Journal Title: Nature. Volume: Oct 15;526(7573) Pages: 397-401
  • DOI: 10.1038/nature14909.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Analysis of the subcellular localization of the human histone methyltransferase SETDB1. (2015)
  • Author(s): Tachibana K, Gotoh E, Kawamata N, Ishimoto K, Uchihara Y, Iwanari H, Sugiyama A, Kawamura T, Mochizuki Y, Tanaka T, Sakai J, Hamakubo T, Kodama T, Doi T.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: Oct 2;465(4) Pages: 725-31
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.08.065.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] MicroRNA-153 Regulates the Acquisition of Gliogenic Competence by Neural Stem Cells. (2015)
  • Author(s): Tsuyama J, Bunt J, Richards LJ, Iwanari H, Mochizuki Y, Hamakubo T, Shimazaki T, Okano H.
  • Journal Title: Stem Cell Reports. Volume: Sep 8;5(3) Pages: 365-77
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2015.06.006.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 90Y-Labeled Anti-ROBO1 Monoclonal Antibody Exhibits Antitumor Activity against Small Cell Lung Cancer Xenografts. (2015)
  • Author(s): Fujiwara K, Koyama K, Suga K, Ikemura M, Saito Y, Hino A, Iwanari H, Kusano-Arai O, Mitsui K, Kasahara H, Fukayama M, Kodama T, Hamakubo T, Momose T.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: May 27;10(5) Pages: e0125468
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0125468.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Lysophosphatidylcholine promotes SREBP-2 activation via rapid cholesterol efflux and SREBP-2-independent cytokine release in human endothelial cells. (2015)
  • Author(s): Morita M, Sekine A, Urano Y, Nishimura T, Takabe W, Arai H, Hamakubo T, Kodama T, Noguchi N.
  • Journal Title: J Biochem. Volume: Oct;158(4) Pages: 331-8
  • DOI: 10.1093/jb/mvv044.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Factor H-related protein 5 interacts with pentraxin 3 and the extracellular matrix and modulates complement activation. (2015)
  • Author(s): Csincsi ÁI, Kopp A, Zöldi M, Bánlaki Z, Uzonyi B, Hebecker M, Caesar JJ, Pickering MC, Daigo K, Hamakubo T, Lea SM, Goicoechea de Jorge E, Józsi M.
  • Journal Title: J Immunol. Volume: May 15;194(10) Pages: 4963-73
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1403121.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] がんの放射線抗体治療について (2016)
  • Author(s): 浜窪 隆雄
  • Organizer: お茶の水がん学アカデミア第120回集会
  • Place of Presentation: 順天堂大学(東京）
  • Year and Date: 2016-01-20 – 2016-01-20
  • Invited
• [Presentation] 病原体排除の関わるペントラキシン3の敗血病への効果 (2015)
  • Author(s): 早田 敬太,浜窪 隆雄
  • Organizer: 第44回日本免疫学会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] がんの抗体PETイメージングと抗体放射線治療について (2015)
  • Author(s): 浜窪 隆雄
  • Organizer: 第30回日本薬物動態学会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀（東京）
  • Year and Date: 2015-11-12 – 2015-11-12
  • Invited
• [Presentation] Protective Effect of Pentraxin 3 in Animal Models of Sepsis (2015)
  • Author(s): Takao Hamakubo,Rie Fukuda,Hiroko Iwanari, ,Keita Soda,Kenji Daigo
  • Organizer: Targeting Ebola Paris2015
  • Place of Presentation: パリ（フランス）
  • Year and Date: 2015-05-28 – 2015-05-29
  • Int'l Joint Research
• [Book] サイエンスシグナリングジャパン (2015)
  • Author(s): 太期 健二、津本 浩平、浜窪 隆雄
  • Total Pages: 2
  • Publisher: 米国科学振興協会
• [Remarks] 浜窪隆雄研究室
  • URL: http://www.qbm.rcast.u-tokyo.ac.jp/