2013 Fiscal Year Annual Research Report
ケミカルバイオロジーを利用したヒトヌクレオチド除去修復機構の解析
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25281017
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
松永 司 金沢大学, 薬学系, 教授 (60192340)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
猪部 学 金沢大学, 薬学系, 准教授 (10312414)
若杉 光生 金沢大学, 薬学系, 助教 (80345595)
国嶋 崇隆 金沢大学, 薬学系, 教授 (10214975)
後藤 享子 金沢大学, 薬学系, 准教授 (50180245)
小田 彰史 金沢大学, 薬学系, 准教授 (50433511)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ケミカルバイオロジー / 化合物ライブラリー / スクリーニング / ヌクレオチド除去修復 / 阻害剤 / 低分子化合物 |
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| Research Abstract |
A. 新規NER阻害物質の探索と同定
１）大規模ケミカルライブラリーを用いた新規NER阻害物質の探索：東大創薬オープンイノベーションセンターのコアライブラリー9,600化合物のうち半数以上のスクリーニングを完了し、5種類の陽性化合物を得た。活性の高いものについては類縁化合物を入手あるいは合成し、部分的な構造活性相関情報を得た。
２）理研NPDepoライブラリースクリーニングから得た２種類の低活性化合物の解析：これまでに見つけた阻害活性の弱い２種類の化合物について、構造類縁体を入手して活性の高い化合物を探索したが、残念ながら期待するものは得られなかった。
B. NER阻害物質NERiKU001の解析
１）標的因子の同定とNER阻害機序の解析：標的因子の特定のために、化合物ビーズを利用した方法で結合タンパクをMS解析により同定し、候補因子を得た。現在、siRNA によるノックダウンによりERCC1-XPF の細胞内レベルが変動するか解析を行っている。一方、NERiKU001がERCC1のプロテアソーム依存的分解を誘導する際のE3リガーゼを特定するために、モニター細胞としてEGFP-ERCC1融合タンパクを安定発現する細胞株を樹立し、実際にNERiKU001処理で蛍光が減少することを確認した。また、ERCC1がユビキチン化されることを実証するためのユビキチン化タンパク検出系を導入し、検討を行っている。
２）化合物の最適化：これまでに入手した約100種類の構造類縁体の修復阻害活性をもとに、そこから絞り込んだ化合物のERCC1-XPF減少活性と細胞毒性を測定し、各々についての構造活性相関を検討した。その結果、両者の活性は分離可能であることがわかり、各々の活性に重要な構造部分を同定し、より高活性・低毒性の化合物を得ることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画はおおむね達成することができたが、NERiKU001結合ビーズの作製に時間を要したことと明瞭な特異バンドが得られなかったことから、現時点で標的因子を結論的に特定するまで至らなかったことは残念である。また、ERCC1-XPFの分解に関与するE3リガーゼの同定やその誘導メカニズムの解析もやや遅れ気味であり、今後スピードアップが必要である。一方で、NERiKU001の構造活性相関はかなり明確になり、活性と毒性の各々に関与する構造部分を特定でき、最適化に一歩近づいたことは大きな成果である。これによりウェットの実験での最適化はほぼ完了し、今後は標的因子の結晶構造をもとにしたインシリコでの最適化を待たなければならない。その意味でも、またNER阻害メカニズムの解明の点からも標的因子の同定は急務である。一方、新規のライブラリースクリーニングについては半数以上が終わった段階で５つの陽性化合物が得られたことは、ほぼ期待どおりの数と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画に大きな変更はなく、計画より遅れている上述の２点について全力をあげるとともに、当初の計画に従って着実に研究を進行させる。また、半分強が終了した新規のスクリーニングについても、残りを可能な限り早く完了させる。最終的に10個前後の陽性化合物が得られると予想しており、絞り込みを行いながら優先順位を決め、NERiKU001に続く解析を並行的に進展させて細胞内におけるNERのメカニズム解明に貢献したい。
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[Journal Article] Proteasome inhibitors and knockdown of SMG1 cause accumulation of Upf1 and Upf2 in human cells.2014
Author(s)
Zhao, X., Nogawa, A., Matsunaga, T., Takegami, T., Nakagawa, H. and Ishigaki, Y.
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Journal Title
Int. J. Oncol.
Volume: 44
Pages: 222-228
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] The scaffold protein JLP plays a key role in regulating ultraviolet B-induced apoptosis in mice.2014
Author(s)
Enkhtuya, R., Sato, T., Wakasugi, M., Tuvshintugs, B., Miyata, H., Sakurai, T., Matsunaga, T. and Yoshioka, K.
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Journal Title
Genes Cells
Volume: 19
Pages: 350-358
DOI
Peer Reviewed
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