2014 Fiscal Year Annual Research Report
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25282128
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
山本 希美子 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (00323618)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安藤 譲二 獨協医科大学, 医学部, 特任教授 (20159528)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 流れずり応力 / 血管内皮細胞 / 細胞膜 / コレステロール / カベオラ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血管内面を一層に覆う血管内皮細胞には血流に起因する力学的な刺激である流れ剪断応力（shear stress）が作用し、血管の機能を調節しているが、内皮細胞がshear stressを感知する分子機構は明らかではない。以前我々はヒト肺動脈内皮細胞（HPAECs）にshear stressを負荷すると、内因性ATPが細胞外へ放出し、細胞膜に発現するATP受容体であるP2X4を活性化することで細胞内へCa2+を流入させること、そしてその情報伝達機構が血圧や血管のリモデリングを含む循環機能を調節することを明らかにした。また、独自に開発したATPイメージング法により、shear stress依存的なATP放出とCa2+流入反応は同一局所の細胞膜カベオラから起こることを観察した。以上の結果を基に、shear stressのセンシング機構として細胞形質膜の物理的性質がshear stressにより変化し、それが様々な膜分子の活性化を引き起こす可能性を考えた。そこで、HPAECsにshear stressを作用させた時の細胞膜のlipid orderの変化を二光子レーザー顕微鏡とLaurdan蛍光色素で解析した。Shear stressを作用させると即座に細胞膜のlipid orderが減少し、膜の流動性が増加した。この変化は人工脂質二分子膜ジャイアント・リポソームでも観察されたことから、物理現象であることが証明された。さらに、細胞膜流動性の変化により、膜分子である血管内皮増殖因子受容体（VEGF）が活性化されることも明らかにした。以上の結果はshear stressによる膜流動性の変化が内皮細胞のセンシングに重要な役割を果たすことを示唆する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
申請当初は流れずり応力に対する内皮細胞形質膜がどの様に応答するのか、その分子機構を解明することが目的であったが、流れずり応力に加えて、血行力学因子の一つである伸展張力についても、同様の検討を加えた所、大変興味深い事に、流れずり応力とは全く異なる反応がある事を発見した。流れずり応力に対して、内皮細胞形質膜のlipid orderは減少し、細胞膜の流動性が増大する一方、伸展張力刺激に対しては、lipid orderが増大し、膜の流動性は低下するという逆の傾向が顕著に認められた。異なる種類の力学的な血流刺激に対して、内皮細胞形質膜の物理的な性質が選択的に変化するという事実は、細胞膜自身が血流センサーとして機能する可能性を強く支持する。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度はこれまで得られた知見を基として、膜分子の力学応答と細胞形質膜及び膜ﾐｸﾛﾄﾞﾒｲﾝの挙動に関する解析を行う。流れずり応力や伸展張力、低浸透圧といった物理的な血行力学因子のｶﾙｼｳﾑｼｸﾞﾅﾘﾝｸﾞを介した情報伝達は特に内皮細胞において、スフィンゴ脂質やコレステロールが高密度に存在するラフトやカベオラといった脂質ﾐｸﾛﾄﾞﾒｲﾝから起こる。培養血管内皮細胞に流れ負荷装置や伸展張力負荷装置を用いて定量的な血行力学因子を作用させたときの細胞膜の流動性および膜リン脂質の相転移の変化を解析すると共に、膜脂質のﾘｱﾙﾀｲﾑｲﾒｰｼﾞﾝｸﾞや、形質膜組成の定性・定量解析を以下の方法を用いて行う。
1)ヒト肺動脈内皮細胞(HPAECs)の膜流動性は蛍光消光回復法で得られた拡散係数を比較検討する。2)膜リン脂質の相転移では、蛍光プローブLaurdanで標識したHPAECsを２光子レーザ顕微鏡を用いて細胞膜のlipid-orderを算出し、リアルタイムでの膜の物理状態を観察する。さらに、人工脂質二分子膜で構成されたジャイアント・リポソームでも同様の検討を行う。3)Caveolin-1とcavin-1の一分子蛍光イメージングでは、緑色蛍光蛋白（GFP）や赤色蛍光分子（mCherry）を融合させたcaveolin-1とcavin-1タンパクをHeLa細胞及び、HEK293細胞に発現させ、全反射顕微鏡を用いて一分子イメージングを行う事により、それぞれの蛋白の相互作用や動態を観察する。4)膜リン脂質及びコレステロールのリアルタイムイメージングにおいては、コレステロールに特異的に結合するθ毒素と緑色蛍光蛋白（GFP）の融合タンパクを合成・精製し、血行力学因子負荷前後での細胞膜コレステロールの分布の変化を蛍光顕微鏡で観察すると共に、フローサイトメトリーを用いて、細胞膜コレステロールの定量解析も行う。5)内皮細胞形質膜の組成の定性・定量解析では、液体クロマトグラフィ・質量分析解析を行う。
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