EBウイルスの潜伏感染の原因となる膜タンパク質LMP1の構造と機能相関の解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25282230
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 井上 豪 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20263204)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安居 輝人 大阪大学, 微生物病研究所, 准教授 (60283074)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: Epstein-Barr（EB）ウイルス / 潜伏感染 / 不死化機構 / 膜蛋白質 / Ⅹ線構造解析 / 精製 / 結晶化

Outline of Annual Research Achievements

リンパ腫、ホジキン病、上咽頭がん、胃がんなど種々の悪性腫瘍や自己免疫疾患を引き起こすことが知られるEpstein-Barr（EB）ウイルスは、Bリンパ球に「潜伏感染」するヘルペスウイルスであり、その「潜伏感染」の原因の１つである膜タンパク質LMP1に焦点をあてた創薬は急務の課題である。
本研究課題では、感染したBリンパ球の不死化機構、および増殖のシグナル伝達の分子機構に深く関わる膜タンパク質LMP1の構造をⅩ線回折法で明らかとすることを目的として、まずは全長およびC末端ドメインの精製に取り組んだ。
全長のLMP1の発現法は確立できてはいるが、大量の膜蛋白質の高純度サンプルを必要とする上に、高濃度が必要である。何度か濃縮を試みたものの、結晶化に必要な1 mg/ml以上の濃度にはならず、凝集が観測され、最終的には結晶を得るには種々の界面活性剤を試しLMP1に適した可溶化剤を見つける以外に方法がないことが判明した。
一方、C末端ドメインについては引き続き精製および結晶化に注力しているが、種々の条件で微結晶が得られるものの、強力な放射光実験施設のⅩ線を用いても回折斑点が得られず、構造解析には至らなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

（１）H26年度と同様、LMP1のfull lengthの発現を、大腸菌、酵母、Sf9昆虫細胞といったホストで試み、目的とするLMP1タンパク質を様々な界面活性剤を用いて可溶化を行い、精製を試みた。酵母および昆虫細胞を用いた場合には発現が見られ、特に酵母を用いた系で何度もLMP1を可溶化、大量精製を試みたが、わずかな精製量しか収穫できず、その純度も低く、分解産物が常に生じてしまい、高純度サンプルを得ることが出来なかった。同様に、Cre/loxPシステムを用いた系でも発現させ、His-tagを用いたアフィニティー精製を繰り返したが、目的タンパク質は精製後、濃縮すると凝集してしまい、希薄な溶液状態では沈殿すら生じず、結晶化条件の検索が困難を極めている。安定性向上に向け様々な添加剤を加えるなどの工夫を試みている。

（２）今年度はＣ末端の細胞質ドメインCTAR1（LMP1CPD）のC238sの変異体について昨年度に引き続き高純度精製を繰り返し行い、結晶化のためのサンプルを得るに至っている。しかし、10L培養で得られる精製量は未だ10～30μLの結晶化サンプルしか得られず、大量の結晶化条件の検索を行うことができない。僅かの数の条件で少しずつ結晶化を試みてはいるものの、昨年度得られたポリエチレングリコール350を用いた微結晶（下図）より良い結晶はえられていない。

（３）CTAR1（LMP1CPD）c238s変異体とFab化抗体との複合体結晶は、昨年度の６条件で得られたものについては全て塩であることが判明し、新たな条件での結晶化を試みており、結晶化に向けた大量精製を繰り返している。

Strategy for Future Research Activity

引き続きFull lengthの大量精製法の確立と結晶化を試みる予定であるが、目下、LMP1CPD単独、および抗体との複合体で微結晶が得られつつあり、結晶化条件の最適化による高品質結晶の取得を目指している。良好な結晶が得られた場合には大型放射光実験施設においてデータ集を行い、細胞質ドメインの構造を明らかにする予定である。

Research Products

• [Journal Article] Redox-coupled structural changes in nitrite reductase revealed by serial femtosecond and microfocus crystallography (2016)
  • Author(s): Yohta Fukuda, Tse Ka Man, Mamoru Susuki, Kay Diederichs, Kunio Hirata, Takanori Nakane, Michihiro Sugahara, Eriko Nango, Kensuke Tono, Yasumasa Joti, Takashi Kameshima, Changyong Song, Takaki Hatsui, Makina Yabashi, Osamu Nureki, Hiroyoshi Matsumura, Tsuyoshi Inoue, So Iwata, Eiichi Mizohata
  • Journal Title: J. Biochem., Volume: 159（５） Pages: 524-538
  • DOI: 10.1093/jb/mvv133.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structure-based design and synthesis of a bivalent iminobiotin analogue showing strong affinity toward a low immunogenic streptavidin mutant (2015)
  • Author(s): Tatsuya Kawato, Eiichi Mizohata, Yohei Shimizu, Tomohiro Meshizuka, Tomohiro Yamamoto, Noriaki Takasu, Masahiro Matsuoka, Hiroyoshi Matsumura, Tatsuhiko Kodama, Motomu Kanai, Hirofumi Doi, Tsuyoshi Inoue, Akira Sugiyama
  • Journal Title: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Volume: 79（44） Pages: 640-642
  • DOI: 10.1080/09168451.2014.991692.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The N-terminal acidic residue of the cytosolic helix 8 of an odorant receptor is responsible for different response dynamics via G-protein (2015)
  • Author(s): Takashi Kawasaki, Takahiro Saka, Shouhei Mine, Eiichi Mizohata, Tsuyoshi Inoue, Hiroyoshi Matsumura, and Takaaki Sato
  • Journal Title: FEBS Lett., Volume: 589（10） Pages: 1136-1142
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2015.03.025
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of protein seed crystals reinforced by high-strength hydrogels (2015)
  • Author(s): Shigeru Sugiyama, Noriko Shimizu, Keisuke Kakinouchi, Osamu Hiraoka, Hiroyoshi Matsumura, Hiroshi Y. Yoshikawa, Yoshinori Takahashi, Mihoko Maruyama, Masashi Yoshimura, Hiroaki Adachi, Kazufumi Takano, Satoshi Murakami, Tsuyoshi Inoue, Michio Murata, and Yusuke Mori
  • Journal Title: CrystEngComm, Volume: 17 Pages: 8064-8071
  • DOI: 10.1039/C5CE00844A
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Insights into unknown foreign ligand in copper nitrite reductase (2015)
  • Author(s): Yohta Fukuda, Tse Ka Man, Yuji Kado, Eiichi Mizohata, Hiroyoshi Matsumura, Tsuyoshi Inoue
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun., Volume: 464（２） Pages: 622-628
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.07.025. Epub
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Epiregulin recognition mechanisms by anti-epiregulin antibody 9E5: Structural, functional and molecular dynamics simulation analyses (2015)
  • Author(s): Yuji Kado, Eiichi Mizohata, Satoru Nagatoishi, Mariko Iijima, Keiko Shinoda, Takamitsu Miyafusa, Taisuke Nakayama, Takuma Yoshizumi, Akira Sugiyama, Takeshi Kawamura, Young-Hun Lee, Hiroyoshi Matsumura, Hirofumi Doi, Hideaki Fujitani, Tatsuhiko Kodama, Yoshikazu Shibasaki, Kouhei Tsumoto and Tsuyoshi Inoue
  • Journal Title: J. Biol. Chem., Volume: 291 Pages: 2319-2330
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.656009. Epub
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Redox-coupled proton transfer mechanism in nitrite reductase revealed by femtosecond crystallography (2015)
  • Author(s): Yohta Fukuda, Ka Man Tse, Takanori Nakane, Toru Nakatsu, Mamoru Suzuki, Michihiro Sugahara, Shigeyuki Inoue, Tetsuya Masuda, Fumiaki Yumoto, Naohiro Matsugaki, Eriko Nango, Tsuyoshi Inoue, So Iwata, Eiichi Mizohata、et. el
  • Journal Title: PNAS., Volume: 55 Pages: 050302
  • Peer Reviewed / Open Access