2016 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the correlation between the structure of the membrane protein LMP1 derived from EB virus and its function of latent infection
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25282230
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
井上 豪 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20263204)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安居 輝人 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 感染症制御プロジェクト, プロジェクトリーダー (60283074)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Epstein-Barr（EB）ウイルス / 潜伏感染 / 不死化機構 / 膜蛋白質 / Ⅹ線構造解析 / 精製 / 結晶化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
リンパ腫、ホジキン病、上咽頭がん、胃がんなど種々の悪性腫瘍や自己免疫疾患を引き起こすことが知られるEpstein-Barr（EB）ウイルスは、Bリンパ球に「潜伏感染」するヘルペスウイルスであり、その「潜伏感染」の原因の１つである６回膜貫通型膜蛋白質LMP1および12回膜貫通型膜蛋白質LMP2に焦点をあてた創薬は急務の課題である。
本研究課題では、感染したBリンパ球の不死化機構、および増殖のシグナル伝達の分子機構に深く関わる膜蛋白質の１つLMP1のⅩ線構造を明らかとするため、まずは全長およびC末端ドメインの精製および結晶化に取り組んだ。
膜蛋白質LMP1の全長については、Cre/loxPシステムを用いた系で、C末端にGFPを融合したタンパク質として発現するよう大腸菌のほか、酵母やSf9昆虫細胞に遺伝子を組み込み、His-tagを用いたアフィニティー精製を繰り返した。精製の際に沈殿を生じやすいことから、Argや界面活性剤のほか、抗体を用いた高純度サンプルの精製方法を確立した。しかし、結晶化の際に必要な、高濃度サンプル（少なくとも1 mg/ml以上）を得る際に、濃縮する段階でその多くが凝集し、沈殿となった。
一方、LMP1のC末端領域(CTAR1)については、この領域を認識する抗体1D11を用いて高純度に精製する方法を確立した。CTAR1と1D11抗体の複合体と考えられる結晶も複数の条件で得られた。結晶化条件の最適化を行い、6%のエチレングリコールを添加剤とした、10%PEG6000で結晶化した場合が最も高分解能で良質となり、1.9Å分解能のⅩ線回折強度データを収集し、構造を解析した。しかし、得られた結晶の非対称単位中には抗体分子のみが存在した。他の結晶化条件についても解析を試みたが、低pHの結晶化条件ではCTAR1が外れる傾向があり、結晶化条件の最適化を継続している。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Causes of Carryover |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(13 results)
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[Journal Article] A RuBisCO-mediated carbon metabolic pathway in methanogenic archaea.2017
Author(s)
Takunari Kono, Sandhya Mehrotra, Chikako Endo, Natsuko Kizu, Mami Matusda, Hiroyuki Kimura, Eiichi Mizohata, Tsuyoshi Inoue, Tomohisa Hasunuma, Akiho Yokota, Hiroyoshi Matsumura & Hiroki Ashida.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 8
Pages: 14007
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] A trimeric structural fusion of an antagonistic tumor necrosis factor-α mutant enhances molecular stability and enables facile modification2017
Author(s)
Masaki Inoue, Daisuke Ando, Haruhiko Kamada, Shintaro Taki, Mayumi Niiyama, Yohei Mukai, Takashi Tadokoro, Katsumi Maenaka, Taisuke Nakayama, Yuji Kado, Tsuyoshi Inoue, Yasuo Tsutsumi and Shin-ichi Tsunoda
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Journal Title
J. Biol. Chem.,
Volume: in press
Pages: in press
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Protein crystallization with paper2016
Author(s)
Miki Matsuoka, Keisuke Kakinouchi, Hiroaki Adachi, Mihoko Maruyama, Shigeru Sugiyama, Satoshi Sano, Hiroshi Y. Yoshikawa, Yoshinori Takahashi, Masashi Yoshimura, Hiroyoshi Matsumura, Satoshi Murakami, Tsuyoshi Inoue, Yusuke Mori and Kazufumi Takano
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Journal Title
Jpn. J. Appl. Phys.,
Volume: 55
Pages: 050302
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Redox-coupled structural changes in nitrite reductase revealed by serial femtosecond and microfocus crystallography2016
Author(s)
Yohta Fukuda, Tse Ka Man, Mamoru Susuki, Kay Diederichs, Kunio Hirata, Takanori Nakane, Michihiro Sugahara, Eriko Nango, Kensuke Tono, Yasumasa Joti, Takashi Kameshima, Changyong Song, Takaki Hatsui, Makina Yabashi, Osamu Nureki, Hiroyoshi Matsumura, Tsuyoshi Inoue, So Iwata, Eiichi Mizohata
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Journal Title
J. Biochem.,
Volume: 159（５）
Pages: 524-538
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Molecular Mechanism Underlying Promiscuous Polyamine Recognition bySpermidine Acetyltransferase2016
Author(s)
Shigeru Sugiyama, Sae Ishikawa, Hideyuki Tomitori, Mayumi Niiyama, Mika Hirose, Yuma Miyazaki, Kyohei Higashi, Michio Murata, Hiroaki Adachi, Kazufumi Takano, Satoshi Murakami, Tsuyoshi Inoue, Yusuke Mori, Keiko Kashiwagi, Kazuei Igarashi, Hiroyoshi Matsumura
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Journal Title
Int J Biochem Cell B
Volume: 76
Pages: 87-97
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] A crystallization technique for obtaining large protein crystals with increased mechanical stability using agarose gel combined with a stirring technique2016
Author(s)
Mihoko Maruyama, Yuki Hayashi, Hiroshi Y. Yoshikawa, Shino Okada, Haruhiko Koizumi, Masaru Tachibana, Shigeru Sugiyama, Hiroaki Adachi, Hiroyoshi Matsumura, Tsuyoshi Inoue, Kazufumi Takano, Satoshi Murakami, Masashi Yoshimura and Yusuke Mori
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Journal Title
J. Crystal Growth.,
Volume: 452
Pages: 172-178
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Promotion of protein crystal growth by actively switching crystal growth mode via femtosecond laser ablation2016
Author(s)
Yusuke Tominaga, Mihoko Maruyama, Masashi Yoshimura, Haruhiko Koizumi, Masaru Tachibana, Shigeru Sugiyama, Hiroaki Adachi, Katsuo Tsukamoto, Hiroyoshi Matsumura, Kazufumi Takano, Satoshi Murakami, Tsuyoshi Inoue, Hiroshi Y. Yoshikawa and Yusuke Mori
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Journal Title
Nature Photonics.,
Volume: 10
Pages: 723-726
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Ubiquitination of Lysine 867 of the Human SETDB1 Protein Upregulates Its Histone H3 Lysine 9 (H3K9) Methyltransferase Activity2016
Author(s)
Kenji Ishimoto, Natsuko Kawamata, Yoshie Uchihara, Moeka Okubo, Reiko Fujimoto, Eiko Gotoh, Keisuke Kakinouchi, Eiichi Mizohata, Nobumasa Hino, Yoshiaki Okada, Yasuhiro Mochizuki, Toshiya Tanaka, Takao Hamakubo, Juro Sakai, Tatsuhiko Kodama, Tsuyoshi Inoue, Keisuke Tachibana, Takafumi Doi
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Journal Title
PLOS ONE.,
Volume: 11
Pages: e0165766
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Structural Bioinorganic Chemistry of Copper Enzymes2016
Author(s)
Yohta Fukuda, Eiichi Mizohata, Tsuyoshi Inoue
Organizer
The 4th International Symposium for Young Chemists on Stimuli-Responsive Chemical Species for the Creation of Functional Molecules
Place of Presentation
大阪大学吹田キャンパス 工学研究科サントリーメモリアルホール（大阪府・吹田市）
Year and Date
2016-12-12 – 2016-12-13
Int'l Joint Research / Invited
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