2013 Fiscal Year Annual Research Report
加齢性疾患にみられる蛋白質異常凝集の機構解明とその修復
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25288075
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
藤井 紀子 京都大学, 原子炉実験所, 教授 (90199290)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加治 優一 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (50361332)
大神 信孝 中部大学, 生命健康科学部, 准教授 (80424919)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | D-アミノ酸 / 老化 / 蛋白質 / 異常凝集 |
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| Research Abstract |
蛋白質はL-アミノ酸のみから構成されているために正しい折りたたみ構造を形成し、その機能を発揮している。しかし、近年、白内障、加齢性黄斑変性症、アルツハイマー病、加齢性難聴等、種々の加齢性疾患の原因蛋白質中にD-β-アスパラギン酸（Asp）が蓄積していることが明らかとなってきた。蛋白質中にD-β-Aspが生成されると蛋白質の高次構造が乱れ、蛋白質の変性や異常凝集が起こる。上記の疾患では、蛋白質中でのD-β-Asp生成→D-β-Asp含有蛋白質の蓄積→蛋白質の異常凝集化→蛋白質の不溶化の過程が共通して生じている。本研究では蛋白質中でのD-β-Asp生成を加齢性疾患発症の一因と捉え、D-β-Asp含有蛋白質の微量定量分析の開発、異常凝集過程の追跡、修復機構の解析を行い、D-β-Asp生成機構の化学的解明、ならびにD-Asp含有蛋白質のみを特異的に分解する酵素（D-Aspartyl Endopeptidase、DAEP）の様々な生物種におけるDAEP活性のスクリーニングを行った。これらにより疾患の発症時期の予測、防御、修復、治療への道を探ることが可能となる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
1）老人性白内障の水晶体から立体構造が既知であるβ-, γ-クリスタリンを単離精製し、β-, γ-クリスタリン中のどのAsp残基がどの程度D-β-体化しているのかを定量した。
2）蛋白質中に生ずるAsp残基の異性体はLα, Dα, Lβ-, Dβ-体の4種類の異性体が存在する。本研究ではこれらの4種類のAsp異性体を導入したペプチド (20残基程度)を化学合成し、Asp異性化のkineticsについて検討した。その結果、Lβ-, Dβ-体は安定であることがわかり、生体内でLβ-, Dβ-体を含む蛋白質の蓄積が多いことが説明できた。
3）Asp残基周辺にUVBの波長を吸収するトリプトファン残基を導入したペプチドを合成し、Asp残基の異性化がUVB照射によって促進するかどうかを検討した。その結果、Asp残基周辺にトリプトファン残基を導入したペプチドはコントロールと比較して異性化が進行したことが明らかとなった。
4）液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)による簡便、迅速、正確な蛋白質中の微量Asp残基の異性体部位の分析法を開発した。
5）様々な生物種におけるDAEP活性のスクリーニングを行った結果、脊椎動物以下では、脊索動物（ホヤ類）、棘皮動物（ウニ類）でその活性が認められた。一方、線虫や酵母、細菌類ではDAEP活性を検出することはできなかった。哺乳類におけるDAEP活性は肝臓
で最大であったが、両生類やウニ類では生殖巣や成熟未受精卵でその活性が高かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究推進の成否は蛋白質中のD-β-Asp残基の分析をいかに、簡便に、精度よく、迅速に行うかにかかっている。従来法では蛋白質を精製し、酵素によってペプチドに断片化し、それらペプチドを加水分解し、ジアステレオマー法によってアミノ酸の光学異性体分析を行っていた。この分析法は時間がかかり、多くの試料の分析に適さない。そこで、LC-MSによる従来法とは全く異なる迅速簡便な定量法を確立させた。それにより従来分析が困難であった不溶蛋白質の分析も可能となった。しかし、この方法にもいくつか課題が残されており、研究期間を通じて、より簡便な方法を開発し、この研究の推進を図る。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
25年度の途中より、この研究の推進のために研究協力者を雇用した。
26年度の本研究推進のため、研究協力者の人件費として残した。
引き続き、26年度の本研究推進のため、本人材を確保するため、上記研究協力者の人件費として使用する予定である。
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