2014 Fiscal Year Annual Research Report
トウガラシに見出された強力な二本鎖RNA分解酵素の同定と生体内での役割解明
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25292021
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
細川 宗孝 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (40301246)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
粟野 達也 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (40324660)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | トウガラシ / RNase活性 / ポジショナルクローニング / キクわい化ウイロイド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、トウガラシの葉が持つ強いRNase分解活性の原因遺伝子の同定を目的として実験を行った。前年度の実験より、強いRNase活性の品種間差が単にRNaseの有無によるものとは考えにくいことから、RNaseの同定を目指す一方で、マッピング解析による遺伝子同定からも原因に迫ることにした。強いRNase活性を示すのはCapsicum属でもchinense種である。C.chinense‘Sy-2'は強い活性を示すことを明らかにしているが、本種と比較的活性弱い51系統のF2系統を準備した。これら2品種において2000個のSNPsマーカーを同定した。F2系統のPhenotypingが終了し次第、Genotypingを行う予定にしている。また、これら2品種の葉のRNAの発現を次世代シークエンスで解析した。発現量に差の有る遺伝子は多く発見された。これらの遺伝子を用いたリアルタイムPCRを行って行く必要がある。次に、中圧クロマトによってタンパク質の活性画分を同定した。これらの活性画分を濃縮、精製しウイロイド（キクわい化ウイロイド：CSVd）の分解活性を評価したところ強い活性を確認することが出来た。これらの画分をSDS-PAGEによって電気泳動すると、高分子側（200KDa以上）に活性を持つタンパク質が見られるが、低分子側（20-30KDa）にも活性を持つものが現れる。これらの低分子は、高分子から外れたRNaseではないかと予測している。現在、さらに濃縮を繰り返し低分子側タンパク質の抽出を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
F2の種子すでに揃えているため、解析をすぐに始めていく予定である。電子顕微鏡観察も先行して技術を導入しているため、すぐに実験を開始することが出来る。
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| Strategy for Future Research Activity |
すでに解析を終了しているRNAseqのデータを評価すること、およびSDS-PAGEによって現れる低分子側タンパク質のアミノ酸シークエンスを行う。さらには、ペプチド抗体を作成し、ウエスタンハイブリによって低分子側タンパク質が高分子側タンパク質に結合しているのか否かなどの解析から着手する。優先順位を、１．ポジショナルクローニング、２．高分子タンパク質と低分子タンパク質の関係解析、３．電子顕微鏡観察、として実験を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
F2の次世代シークエンス解析に研究費を残したほうが良いと考え、きちんとした解析が可能なF2系統群の作成および若干の不安が残っているPhenotypingを繰り返すこととしたため、資金がかからなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
27年度はPhenotypingを前半で終え、後半は次世代シークエンスおよびマッピング解析を行う予定である。また、ペプチド抗体の購入など研究費が必要な研究が残されている。
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