2014 Fiscal Year Annual Research Report
陽イオン輸送系の協奏調節による細胞内浸透圧の恒常性の維持機構の解析
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25292055
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
魚住 信之 東北大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (40223515)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 浸透圧 / 耐塩性 / イオン環境 / 輸送体 / シロイヌナズナ / 脂質修飾 / 機能調節 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ルシフェラーゼを導入した植物を用いて発光を実時間発光観察装置で発現量を検出した。概日性を示す輸送体と示さない植物に分類した。また，概日性リズムの振動具合の低い形質転換体も得られており，正確なデータの取得のために今後もデータの取得が必要である。上記までの結果から，概日性ももつ輸送体発現があることが分かった。また，AtHKT1プロモーターの長さを変化したコンストラクトを作成した。GUS活性測定を行ったところ，0.8kbの比較的短いプロモーターは，長いプロモーターと比べて，発現活性が高いことが分かった。このことは，0.8kb上流に発現抑制領域が存在することが予測された。
野生株、athkt1変異株、atnhx1変異株、athkt1,atnhx1の二重変異株の種子の取得の難しいものが見つかった。この変異を分離した植物を用いて，塩ストレスに対する表現型の観察を行った。athkt1変異株は種子形成に影響が出ることが明らかとなった。
シロイヌナズナの6種類のKチャネル（KAT2, AKT1, AKT2, GORK, SROKおよびAtKC1）の機能活性を調べた。リン酸化される可能性のある高く保存されたThrの置換体は，野生型と比べて活性が上昇した。このことは，リン酸化による抑制が機能していることを強く示している。
前年度に検討できなかったCPK1～CPK34、CRK1～CPK8、CBL1,4,5,9のMyristoylation 候補Gly(N末端から2残基目)を含む融合タンパク質に関して，作成した。無細胞翻訳系によって放射性標識によるMyristoylationを行った。これにより，脂肪酸の付加の結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
概日リズムを探るためにプロモーター発現解析から，発現リズムを示す輸送体が明らかとなった。卵母細胞発現系解析により，リン酸基のチャネル活性に寄与するリン酸化アミノ酸が明らかになってきた。脂質修飾の検出も明瞭な結果が得られており，in vitro系を用いたアッセイ系によって植物のタンパク質の脂質修飾が適切にいくことが示された。パルミチン酸修飾は生細胞で行っていたが，免疫沈降によるタンパク質の回収が期待通りではなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に作成した発光蛋白質を導入した植物を用いて，遺伝子発現を実時間発光観察装置で発現量を検出する。 AtHKT1プロモーターの抑制領域が明かとなってきたことからその遺伝子発現を引き続き調べる。また，エコタイプの違いによる塩ストレス適応性の差異を輸送体と関連付ける卵母細胞によって，脂質修飾の中でも，Palmitoylationにむけて，in vitro修飾法で検出を試みる。塩ストレス環境において，花芽形成に影響することが示されたことから，22Na放射性同位体を用いた植物によるイオン吸収と期間蓄積の評価実験をすすめる。脂質修飾は動物細胞のシステムに加えて，植物細胞由来のシステムでも可能であるミリスチン酸の付加反応を行う。
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| Causes of Carryover |
種子形成に時間を要する変異体や，測定項目が当初の予定より増大した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
変異体を取得後，変異体の形態観察を行うとともに，引き続き測定実験を遂行する。
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[Journal Article] Defining membrane spanning domains and crucial membrane-localized acidic amino acid residues for K+ transport of a Kup/HAK/KT-type Escherichia coli potassium transporter2014
Author(s)
Sato, Y., Nanatani, K., Hamamoto, S., Shimizu, M., Takahashi, M., Tabuchi-Kobayashi, M., Mizutani, A., Schroeder, J. I., Soma, S., and Uozumi, N.
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Journal Title
J. Biochem.
Volume: 155
Pages: 315-323
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] The phosphoinositide PI(3,5)P2 mediates activation of mammalian but not plant TPC proteins: functional expression of endolysosomal channels in yeast and plant cells.2014
Author(s)
Boccaccio, A., Scholz-Starke, J., Hamamoto, S., Larisch, N., Festa, M., Gutla, P. V. K., Costa, A., Dietrich, P., Uozumi, N., and Carpaneto, A.
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Journal Title
Cell. Mol. Life Sci.
Volume: 71
Pages: 4275-4283
DOI
Peer Reviewed
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