尿主要タンパク質コーキシンの遺伝子欠損ネコ作製と機能解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25292191
• Research Institution: Iwate University
• Principal Investigator: 山下 哲郎 岩手大学, 農学部, 准教授 (20202377)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮崎 雅雄 岩手大学, 農学部, 准教授 (20392144) ; 片山 泰章 岩手大学, 農学部, 准教授 (70436054) ; 澤井 健 岩手大学, 農学部, 教授 (90390864)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 遺伝子改変動物 / 酵素 / 尿タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、ゲノム編集技術を活用してネコ特有なアミノ酸「フェリニン」の生合成に関わっているネコ尿主要タンパク質「コーキシン」の遺伝子欠損ネコを作成し、尿臭低減ネコの作製とコーキシンの更なる生理機能解明を目指している。今年度はまず培養細胞を使いTALENのコーキシン遺伝子切断活性の向上について検証した。2013年にTALENのゲノム切断活性を向上させる因子としてエクソヌクレアーゼⅠ（ExoI）を共発現させることが有効と報告されている。そこで我々もネコExoI遺伝子をクローニングして発現ベクターを構築し、コーキシンのエクソン2をターゲットにしたTALENとExoIをネコCRFK細胞で共発現させた。その結果、過去の報告と異なりExoI切断活性の効果は認められなかった。次にCRSIPR-CAS9システムを使ったコーキシン欠損効率を検証した。エクソン２領域４か所をターゲットにしてCRISPRを設計し、CRFK細胞の切断活性を調べた。その結果、1つで切断活性の高いCRSIPR-CAS9を得ることができたが、TALENの切断活性よりも低かった為、TALENをネコ受精卵に導入することにした。
メスネコにホルモン処置を施し、過排卵させた後、オスネコと交尾させ、避妊手術で卵管を採取し、卵管洗浄でネコ受精卵を採取した。顕微鏡下で1細胞期の受精卵にTALENのmRNAをマイクロインジェクションしてコーキシン遺伝子欠損卵の作製を試みたが処置3日後に細胞の卵割が停止してしまい、コーキシン遺伝子欠損卵を作成することができなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ネコの交配実験がなかなかうまくいかず、複数回、受精卵を採取する実験ができなかったため、研究の遂行に遅滞が生じた。

Strategy for Future Research Activity

最終年度は、実験動物会社で種付けオスとして販売されているネコを購入し、また繁殖ケージのサイズを大きくしてより交配しやすい環境を準備して、ネコの交配成功率を上げ、定期的にネコの受精卵を採取できるようにしたいと考えている。培養細胞でのTALENの活性は既に確認できているので、遺伝子欠損ネコの作製が作成できたら、直ちにCauxinの分泌量やフェリニン分泌量の増減を調べる予定である。

Causes of Carryover

物品費の当初の見積りと実際の納入価に差が生じたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度の物品費（遺伝子解析用試薬代）の購入に充てる。