アポリポタンパク質によるHDL産生・代謝調節機構の物理化学的基盤解明と創薬展開

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25293006
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 斎藤 博幸 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (60300919)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 笠原 二郎 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 准教授 (10295131)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: アポリポタンパク質 / HDL / ABCトランスポーター / コンフォメーション / コレステロール代謝 / 脂質異常症 / アミロイドーシス

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、血中や中枢神経系（脳内）でのコレステロール代謝平衡を調節しているヘリックス型アポリポタンパク質であるアポA-IとアポEによるHDL産生・代謝調節機構の物理化学的基盤を解明するとともに、HDL代謝制御システムの破綻によって引き起こされる疾患の新たな予防・治療法開発のための科学的基盤構築を目指している。
平成26年度は、アポA-Iによる血漿HDL産生・代謝制御機構に関し、前年度に開発した環境感受性蛍光プローブ標識アポA-I分子を用いて、アポA-Iの抗動脈硬化活性の指標となるHDLからの解離特性（HDL非結合アポA-Iとの交換反応）についての詳細な速度論的・熱力学的解析を行った。その結果、低HDL血症変異アポA-Iでは、この反応遷移エネルギーが高いためにHDL間交換反応が抑制されていることが明らかとなった。さらに、HDLの形成・成熟過程でのアポA-I分子のコンフォメーション変化を認識・識別する抗アポA-I抗体の設計・開発に着手し、いくつかのHDL認識抗体候補を得た。
また、脳内でのHDL形成を担うアポEアイソフォーム間での水溶液構造や動的HDL結合構造の差異を検出することを目的として、ドメイン特異的トリプトファン変異体の設計・作製やヘリックス領域特異的環境感受性蛍光プローブ標識により、アポEアイソフォームの自己会合や脂質膜結合に伴うN末及びC末ドメインの構造変化をそれぞれ独立して評価する手法を確立した。その結果、アポEアイソフォームの脂質膜への結合にはC末領域を介した会合体から単量体への解離過程が律速であること、また、アポE3とE4アイソフォーム間で自己会合性が異なることよって脂質膜へのC末領域の結合速度が異なることを見出し、アイソフォームによる病態発症機序にアミノ酸置換のあるN末領域ではなくC末領域が深く関与する可能性を示唆した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成26年度は、アポA-Iによる血漿HDL産生・代謝調節機構に関し、前年度に開発したアポA-I分子の環境感受性蛍光プローブ標識法を、HDL非結合-結合型構造間の動的平衡コンフォメーション測定に適用した。すなわち、アポA-Iの抗動脈硬化活性の指標となるHDLからの解離特性（HDL非結合アポA-Iとの交換反応）について詳細な速度論的・熱力学的解析を行い、交換反応の遷移エネルギーを観測することに成功した（Biochemistry 54, 1123, 2015）。本手法により、低HDL血症変異アポA-Iでは、この反応遷移エネルギーが高いためにHDL間交換反応が抑制されていることが明らかとなった。さらに、HDLの形成・成熟過程でのアポA-I分子のコンフォメーション変化を認識・識別する抗アポA-I抗体の候補をいくつか得るなど、アポA-I高次構造に基づいたHDL機能の解明に向けた基盤整備が大きく進展した。
また申請者は、アポEアイソフォームの構造情報に基づいた部位特異的システイン残基導入とチオール基反応性/環境感受性蛍光プローブ標識により、アポE分子内のN末及びC末ドメイン各領域の構造特異性や脂質膜結合挙動を独立して評価可能な蛍光分光学的手法を世界で初めて確立している（Biochemistry 51, 5580, 2012; Biochim. Biophys. Acta 1841, 1716, 2014）。本手法を用いて、これまで推定されていたアポEの経時的な二段階脂質膜結合挙動や脂質結合構造の多様性を直接実験的に証明することに初めて成功した。アポEは水溶液中で自己会合によって多量体を形成する傾向が強く、未だNMRやX線結晶構造解析等による詳細構造解明は成功していない。したがって、本研究で確立した領域特異的蛍光分光解析法は、低解像度ながらHDL形成に伴うアポEアイソフォームの高次構造変化をリアルタイムで追跡するには非常に有効であると考えられる。
以上のように、当初の研究計画に対しておおむね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

HDLのコレステロール除去作用には、結合しているアポA-I分子の高次構造（コンフォメーション）が密接に関連していると考えられており、この点で、今年度から作成に着手したアポA-Iコンフォメーション認識抗体は、よりコレステロール除去活性の高いHDLすなわち“善玉HDL”の測定法開発につながる可能性を秘めている。これは、従来の単にHDLコレステロールの“量”を測定する方法ではなく、そのコレステロール除去活性などの機能すなわち“質”を評価するという点で、臨床的意義も非常に大きい。また、アポA-Iコンフォメーション認識抗体は、アミロイドーシス変異アポA-Iの構造転移を伴うアミロイド線維形成を高感度で検出できる可能性もあり、疾患誘発性異常アポA-Iの高感度検出・診断法への応用展開が期待される。そこで平成27年度は、このアポA-Iコンフォメーション認識抗体の開発を積極的に展開する。
一方、アポEアイソフォーム特異的脳内HDL産生・コレステロール輸送機能について、当初計画していた細胞表面糖鎖による制御機構の解明はあまり進展がみられていない。平成27年度は、ヘパラン硫酸やコンドロイチン硫酸を欠損したCHO細胞株や糖鎖結合部位を改変したアポEアイソフォーム変異体などを用いて、アポEによる細胞からのHDLコレステロール産生作用や細胞への接着・取り込み過程などの比較評価を行い、アポEアイソフォームによるHDL産生・コレステロール輸送作用に対するアポE－細胞表面糖鎖相互作用の役割を明らかにする。

Causes of Carryover

ほぼ予算通りの使用であったが、年度末に当たり若干の差額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度交付額と合算して使用予定。

Research Products

• [Journal Article] Membrane Effects of N-Terminal Fragment of Apolipoprotein A-I: A Fluorescent Probe Study. (2015)
  • Author(s): Trusova, V., Gorbenko, G., Girych, M., Adachi, E., Mizuguchi, C., Sood, R., Kinnunen, P., and Saito, H.
  • Journal Title: J. Fluoresc. Volume: 25 Pages: 253-261
  • DOI: 10.1007/s10895-015-1501-9
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Molecular complex composed of β-cyclodextrin-grafted chitosan and pH-sensitive amphipathic peptide for enhancing cellular cholesterol efflux under acidic pH. (2015)
  • Author(s): Takechi-Haraya, Y., Tanaka, K., Tsuji, K., Asami, Y., Izawa, H., Shigenaga, A., Otaka, A., Saito, H., and Kawakami, K.
  • Journal Title: Bioconjugate Chem. Volume: 26 Pages: 572-581
  • DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.5b00037
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Kinetic and Thermodynamic Analyses of Spontaneous Exchange between High Density Lipoprotein-Bound and Lipid-Free Apolipoprotein A-I. (2015)
  • Author(s): Handa, D., Kimura, H., Oka, T., Takechi, Y., Okuhira, K., Phillips, M. C., and Saito, H.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 54 Pages: 1123-1131
  • DOI: 10.1021/bi501345j
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Fluorescence Study of Domain Structure and Lipid Interaction of Human Apolipoproteins E3 and E4. (2014)
  • Author(s): Mizuguchi, C., Hata, M., Dhanasekaran, P., Nickel, M., Phillips, M. C., Lund-Katz, S., and Saito, H.
  • Journal Title: Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Biol. Lipids Volume: 1841 Pages: 1716-1724
  • DOI: 10.1016/j.bbalip.2014.09.019
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Direct Detection of ABCA1-dependent HDL Formation Based on Lipidation-induced Hydrophobicity Change in ApoA-I. (2014)
  • Author(s): Omura, R., Nagao, K., Kobayashi, N., Ueda, K., and Saito, H.
  • Journal Title: J. Lipid Res. Volume: 55 Pages: 2423-2431
  • DOI: 10.1194/jlr.D049445
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Influence of Domain Stability on the Properties of Human Apolipoprotein E3 and E4 and Mouse Apolipoprotein E. (2014)
  • Author(s): Nguyen, D., Dhanasekaran, P., Nickel, M., Mizuguchi, C., Watanabe, M., Saito, H., Phillips, M. C., and Lund-Katz, S
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 53 Pages: 4025-4033
  • DOI: 10.1021/bi500340z
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] アルギニン変異apoA-Iフラグメントのアミロイド線維形成性 (2015)
  • Author(s): 三河志穂，水口智晴，辻耕平，馬場照彦，重永章，大高章，斎藤博幸
  • Organizer: 日本薬学会第135年会
  • Place of Presentation: 神戸サンボーホール（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-28
• [Presentation] バイオレイヤー干渉法を用いた人工HDL粒子と抗apoA-I抗体との相互作用評価 (2015)
  • Author(s): 木村仁，原矢佑樹，小林典裕，斎藤博幸
  • Organizer: 日本薬学会第135年会
  • Place of Presentation: 神戸サンボーホール（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-28
• [Presentation] ヒトアポA-I結合タンパク質AIBPの大腸菌発現系の構築と細胞内局在 (2015)
  • Author(s): 杉原涼，長尾耕治郎，奥平桂一郎，斎藤博幸
  • Organizer: 日本薬学会第135年会
  • Place of Presentation: 神戸サンボーホール（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-28
• [Presentation] トリプトファン変異導入によるアポEアイソフォームの二ドメイン構造の比較評価 (2015)
  • Author(s): 水口智晴，端茉美，Phillips, M.C.，Lund-Katz, S，斎藤博幸
  • Organizer: 日本薬学会第135年会
  • Place of Presentation: 神戸学院大学（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-28
• [Presentation] アミロイドーシスの病態解明を目指したApoA-Iモノクローナル抗体の作製 (2015)
  • Author(s): 堀江有紀，土屋沙織，大山浩之，小林典裕，斎藤博幸
  • Organizer: 日本薬学会第135年会
  • Place of Presentation: 神戸サンボーホール（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-28
• [Presentation] Arginine- Glycosaminoglycan Interaction Regulates Penetration Efficiency of Arginine-rich Cell-penetrating Peptides in Biological Membrane. (2015)
  • Author(s): Takechi Y., Yanagisawa Y., Nishitsuji K., Uchimura K., Kawakami T., Kawakami K., Okuhira K., Saito H.
  • Organizer: Biophysical Society 59th Annual Meeting
  • Place of Presentation: Baltimore (Maryland, USA)
  • Year and Date: 2015-02-07 – 2015-02-11
• [Presentation] アルギニンペプチドの細胞膜透過性に与えるグリコサミノグリカン糖鎖相互作用の影響 (2014)
  • Author(s): 武知佑樹, 柳澤悠登，西辻和親，川上徹，奥平桂一郎，斎藤博幸
  • Organizer: 膜シンポジウム2014
  • Place of Presentation: 神戸大学（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2014-11-26 – 2014-11-27
• [Presentation] カチオン性ペプチドの細胞膜透過促進機構～アルギニンペプチドのグリコサミノグリカン糖鎖への特異的結合によるα-ヘリックス構造形成～ (2014)
  • Author(s): 武知佑樹, 柳澤悠登，西辻和親，川上徹，川上亘作，奥平桂一郎，斎藤博幸
  • Organizer: 第36回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • Place of Presentation: 徳島大学（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2014-11-20 – 2014-11-21
• [Presentation] 環境感受性蛍光プローブ標識アポA-Iを利用した新規HDL形成検出法の開発 (2014)
  • Author(s): 大村理紗，長尾耕治郎，斎藤博幸
  • Organizer: 第36回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • Place of Presentation: 徳島大学（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2014-11-20 – 2014-11-21
• [Presentation] HDLアポA-Iの自発的交換反応に関する速度論的・熱力学的解析 (2014)
  • Author(s): 半田大祐，岡辰也，武知佑樹，奥平桂一郎，斎藤博幸
  • Organizer: 第36回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • Place of Presentation: 徳島大学（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2014-11-20 – 2014-11-21
• [Presentation] 部位特異的蛍光標識によるアポEアイソフォームの脂質結合挙動の解析 (2014)
  • Author(s): 水口智晴，端茉美，Phillips, M.C.，Lund-Katz, S.，斎藤博幸
  • Organizer: 第36回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • Place of Presentation: 徳島大学（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2014-11-20 – 2014-11-21
• [Presentation] ApoA-I欠損変異体を用いたナノディスクの作製及び物性評価 (2014)
  • Author(s): 新村航，假屋園大和，奥平桂一郎，斎藤博幸
  • Organizer: 第36回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • Place of Presentation: 徳島大学（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2014-11-20 – 2014-11-21
• [Presentation] ApoAIアミロイドの毒性に対するヘパラン硫酸糖鎖の影響 (2014)
  • Author(s): 桑原香織，西辻和親，小林典裕，内村健治，坂下直実，斎藤博幸
  • Organizer: 第36回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • Place of Presentation: 徳島大学（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2014-11-20 – 2014-11-21
• [Presentation] DESIGN OF NANODISC SCAFFOLD PEPTIDE (NSP) (2014)
  • Author(s): 假屋園大和, 新村航，辻耕平，重永章，大高章，斎藤博幸
  • Organizer: 第51回ペプチド討論会
  • Place of Presentation: 徳島大学（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2014-10-22 – 2014-10-24
• [Presentation] ROLE OF GAG INTERCTION IN BIOLOGICAL MEMBRANE PENETRATION OF ARGININE-RICH CELL-PENETRATING PEPTIDE (2014)
  • Author(s): 武知佑樹, 柳澤悠登，西辻和親，川上徹，奥平桂一郎，斎藤博幸
  • Organizer: 第51回ペプチド討論会
  • Place of Presentation: 徳島大学（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2014-10-22 – 2014-10-24
• [Presentation] In cell NMRによるオクタアルギニンペプチドの細胞内輸送のリアルタイム計測と速度論 (2014)
  • Author(s): 武知佑樹, 安岐健三，通山由美，川上徹，斎藤博幸，岡村恵美子
  • Organizer: 第65回コロイドおよび界面化学討論会
  • Place of Presentation: 東京理科大学（東京都新宿区）
  • Year and Date: 2014-09-03 – 2014-09-05
• [Presentation] Real Time in-Cell 19F NMR Spectroscopy on the Cell Membrane Permeation of Octaarginine. (2014)
  • Author(s): Takechi, Y., Aki, K., Tohyama, Y., Kawakami, T., Saito, H., Okamura, E.
  • Organizer: International Conference on Magnetic Resonance for Biological Systems 2014
  • Place of Presentation: Dallas (Texas, USA)
  • Year and Date: 2014-08-24 – 2014-08-29
• [Presentation] ApoAIアミロイドの毒性に対するヘパラン硫酸糖鎖の影響 (2014)
  • Author(s): 桑原香織，西辻和親，小林典裕，内村健治，坂下直実，斎藤博幸
  • Organizer: 第2回日本アミロイドーシス研究会学術集会
  • Place of Presentation: KKRホテル東京（東京都千代田区）
  • Year and Date: 2014-08-22
• [Presentation] MicroCal iTC200による細胞膜透過ペプチド－糖鎖間相互作用の熱力学的解析 (2014)
  • Author(s): 武知佑樹, 水口智晴，川上徹，斎藤博幸
  • Organizer: GE Life Sciences Day 2014
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2014-08-01
• [Presentation] オクタアルギニンの物理的膜透過に関するリアルタイムin cell NMR研究 (2014)
  • Author(s): 武知佑樹, 安岐健三，通山由美，川上徹，斎藤博幸，岡村恵美子
  • Organizer: 日本膜学会第36年会
  • Place of Presentation: 早稲田大学（東京都新宿区）
  • Year and Date: 2014-05-12 – 2014-05-13