2014 Fiscal Year Annual Research Report
C型肝炎ウイルス糖ペプチドを用いた中和抗体作製と、新規診断技術への応用
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25293134
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
清水 弘樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生物プロセス研究部門, 主任研究員 (30344716)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 哲朗 浜松医科大学, 医学部, 教授 (00250184)
奥田 徹哉 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生物プロセス研究部門, 主任研究員 (20443179)
松岡 浩司 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (40272281)
松尾 一郎 群馬大学, 大学院理工学府, 教授 (40342852)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 糖 / 糖ペプチド / 抗体 / Ｃ型肝炎 / 糖鎖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
C 型肝炎ウイルス(HCV) の表層糖タンパクE2のアミノ酸配列はHCV株間で保存性が小さく多様性に富んでいるため，汎用的なE2 検出抗体は確立されていない。しかし，表層抗原のため抗体検出が容易であること，更にはHCV 中和抗体の主要なエピトープを含むことから，目的抗体が開発できれば株間に依存しないHCV 迅速検出系の開発や，有用なHCV 中和抗体の創出が期待できる。本研究では，E2 の中でもアミノ酸配列の保存性が高い糖鎖付加領域に着目し，当領域の糖ペプチド抗原をデザインすることで目的を満たす特異性の高いモノクローナル抗体の開発を目指し，さらにHCV 診断法の確立を指向した基盤研究展開を計る。
目的とする抗体の作製のためには，まず免疫に必要な糖鎖ペプチド抗原を供給する必要がある。昨年度は単糖ペプチド抗原の合成には成功した。そこで今年度はまず，昨年度に引き続き分担者の松尾と研究代表者の清水らが中心に糖鎖ペプチド抗原の合成研究をすすめた。平行して，抗体評価やデバイス開発の基盤研究を展開した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初は平成26年度中に糖ペプチド抗原の合成を行い，さらに平成27年度に予定していた抗体作製と抗体評価を前倒しで進める計画であった。しかし，糖ペプチド抗原の合成は非常に困難をみたため，一時は抗体作製方法から見直して抗原のデザインを変更することも考えたが，研究を進めるうちにいろいろな知見が蓄積し，最終的には「困難であるが不可能ではない」と結論づけ，平成26年度の事業を9ヶ月間延長して，精力的に糖ペプチド抗原の合成研究を進めた。
抗原の作製は，1)単糖ペプチドの合成，2)糖鎖の伸長，3)抗原キャリアの導入の３ステップで完成する。当初は，酵素による糖鎖伸長にコスト的収量的な制限が生じると予想したことから，1)3)2)の順で糖鎖ペプチド抗原の合成を検討した。しかし合成した抗原キャリアを導入した単糖ペプチド基質は水に溶けず，物性の問題で糖鎖伸長酵素反応が全く進行しなかった。
そこで，脂溶性の基質に対する酵素反応で清水らが報告した，有機溶媒混在系やシクロデキストリン混在系、マイクロ波利用など様々な条件下での酵素反応の検討を進めた。その結果，様々な知見を得ることに成功したが，目的とする糖鎖ペプチド抗原の合成には至らなかった。
一方，抗原作製の順番を2)1)3)とする研究も進めた。すなわち，まず糖アミノ酸に糖鎖伸長反応を施し，これを合成シントンとして糖鎖ペプチドを合成，引き続き抗原キャリアを導入するというものである。酵素による糖鎖伸長反応は収率的には改善の余地があったが問題なく進行し，引き続きの糖鎖ペプチド合成，抗原キャリアの導入も反応条件を精査して成功した。最終物である糖鎖ペプチド抗原の精製には課題を残したが，糖鎖ペプチド抗原の合成自体には成功した。
当初は平成27年度に予定していた抗体作製研究を前倒ししてはじめたいと考えていたが，抗原の合成が非常に困難をみたため，基盤となる研究を進めるに留まった。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず，糖鎖ペプチド抗原の必要量の確保と精製の問題点の解決をはかる。当初の予定から，糖鎖伸長の段階を最後の過程から途中の過程に変更したことに係わり，合成スケールの向上が必要となった。そこで，酵素による糖鎖伸長を化学合成による調製に方針を変更する。すなわち，化学法にて５糖アミノ酸シントンを合成後，ペプチド鎖伸長，抗原キャリアの導入をおこない，糖鎖ペプチド抗原の合成を達成させる。
その後，免疫，モノクローナル抗体の作製，抗体の評価，抗体を利用したデバイス開発と研究を展開させる予定である。
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| Causes of Carryover |
抗原の合成後，免疫，モノクローナル抗体の作製，抗体の評価，抗体を利用したデバイス開発という研究展開を計画したが，抗原の合成がかなりの困難となり，合成ルート確立に多くの時間を要した。しかし，実際の実験上でのノウハウに相当する知見が多く得られ一定の成果は得たが，抗原の必要量の完全合成自体には至っておらず，加えて免疫，モノクローナル抗体の作製，抗体の評価などの分が次年度使用額となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ターゲットとした糖ペプチド抗原は同分子内に脂溶性と水溶性が共存することからその合成や精製が非常に困難であった。合成には目処がついたが，実際に免疫に必要な量を得るには至っていない。そこで，糖鎖ペプチド抗原の調製，精製，免疫などに係る研究に費用を充てがう予定である。
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[Journal Article] Involvement of Hepatitis C Virus NS5A Hyperphosphorylation Mediated by Casein Kinase I-alpha in Infectious Virus Production2014
Author(s)
Masaki T, Matsunaga S, Takahashi H, Nakashima K, Kimura Y, Ito M, Matsuda M, Murayama A, Kato T, Hirano H, Endo Y, Lemon SM, Wakita T, Sawasaki T, Suzuki T
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Journal Title
J Virol.
Volume: 88
Pages: 7541-55
DOI
Peer Reviewed
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