生体類似組織構築のための人工細胞外マトリックスの創製

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25293404
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 加藤 功一 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 教授 (50283875)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 谷本 幸太郎 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 教授 (20322240) ; 平田 伊佐雄 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 助教 (40346507) ; 中路 正 富山大学, 先端ライフサイエンス拠点, 特命助教 (10543217)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 軟骨 / スキャホールド / キメラ蛋白質 / 再生医療 / 間葉系幹細胞

Research Abstract

本研究は、組織工学の技術を活用した損傷組織の再生治療に関するものであるが、中でもとくに、顎関節軟骨の再生治療をターゲットとして研究を開始した。顎関節軟骨は基底部の硝子軟骨層および関節摺動面の繊維軟骨からなる複合組織であり、その組織構造が機能発現の鍵を握る。顎関節症に伴う損傷軟骨の再建には間葉系幹細胞を用いた再生治療が有効であると期待されているが、硝子軟骨／繊維軟骨からなる層構造を再建することが難しいため、その治療効果は満足できるものではない。そこで、本研究では、生体類似構造をもつ移植片の調製に適した組織工学足場材料の創製を目的とし、組織誘導因子を部位特異的に担持させた多孔質足場材料の設計に取り組んだ。
本年度はまず、間葉系幹細胞から繊維軟骨および硝子軟骨を形成する細胞の誘導に効果的と考えられるな細胞増殖因子の探索を行った。不死化されたヒト間葉系幹細胞株を用い、標準的な軟骨形成条件にてペレット培養を行った。一定期間後、軟骨基質の生成についてトルイジンブルーおよびアルシアンブルー染色法によって調べ、軟骨特異的マーカーの発現をRT-PCR法を用いて経時的に調べた。その結果、TGF-betaおよびIGF-1による刺激が、とくに繊維軟骨様組織の形成にとって効果的であることがわかった。ただし、硝子軟骨の分化については現在のところ有効な増殖因子は見つかっておらず、今後も引き続き探索を行う。
本年度はさらに、細胞増殖因子と生分解性高分子結合性ペプチドとのキメラタンパク質の合成を開始した。キメラタンパク質の合成には遺伝子組み換え技術および大腸菌発現系を利用している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

軟骨組織の形成実験に適した細胞を選定するため、当初の予定以上に時間を要したのが第一の原因である。また、ペレット培養された組織体の切片作成および染色操作の習得が順調には進まなかった。

Strategy for Future Research Activity

間葉系幹細胞から繊維軟骨および硝子軟骨を形成する細胞の誘導に効果的と考えられる細胞増殖因子に関する評価をさらに進める。さらに、細胞増殖因子と生分解性高分子結合性ペプチドとのキメラタンパク質を合成し、生分解性多孔質足場材料へ担持する。足場材料の素材として脂肪族ポリエステル共重合体に着目し、適切な空隙をもつ多孔質体の作製法を確立する。次に、生体の顎関節軟骨に見られるような複合化組織構造を再現するため、硝子軟骨誘導条件（多孔質構造および誘導因子に基づく）と繊維性軟骨誘導条件を異なる領域に配置させた人工細胞外マトリックスを構築する。複数種類のキメラタンパク質を多孔質足場材料の特定の部位にそれぞれ担持させる方法について検討する。これには、多孔質体の一方向からの含侵や、予め異なる因子を担持させた二つの多孔質体を合着させる方法などを検討する。最後に、得られた人工細胞外マトリックスを用いてin vitro での軟骨形成実験を行う。