2014 Fiscal Year Annual Research Report
乳歯歯髄由来ヒトiPS細胞からの歯形成細胞への分化誘導制御
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25293418
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
齊藤 一誠 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90404540)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山崎 要一 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (30200645)
佐藤 正宏 鹿児島大学, 医療ミニブタ先端医療開発研究センター, 教授 (30287099)
齊藤 陽子 新潟大学, 医歯学系, 助教 (30404487)
稲田 絵美 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 助教 (30448568)
野口 洋文 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733)
大島 勇人 新潟大学, 医歯学系, 教授 (70251824)
松山 清 久留米工業高等専門学校, 生物応用化学科, 准教授 (40299540)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 再生歯学 / iPS細胞 / 乳歯歯髄 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯科臨床において、上下顎20本もある脱落乳歯は子どもの記念に保存する以外はほとんどが廃棄されている。しかし、バイオリサイクルの観点から、乳歯は歯髄幹細胞の有効な細胞供給元として注目されている。本研究では、乳歯由来iPS細胞を用い、歯形成細胞までの分化誘導レベルの制御を目的としている。具体的には、遺伝子工学的手法を用い、分化を体細胞レベルや組織幹細胞レベルに留め、歯を形成する歯構成細胞や歯髄幹細胞・前駆細胞の効率的な取得法の検討を行う。
歯構成細胞や歯髄幹細胞に特異的に稼働するプロモーターを用い、分化誘導レベルを制御するために、まずは、間葉系幹細胞特異的なLEF-1 promoterに着目し、本promoterも可動性について、いくつかのcell lineについて検討を行った。また、PiggyBac系のプラスミドについて、乳歯歯髄由来iPS細胞への遺伝子導入効率の検討を行った結果、非PiggyBac系のプラスミドと比較し、良好な遺伝子導入効率が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度においては、如何に効率良くiPS 細胞へ遺伝子導入するかに関して検討をおこなった。一般的な方法である電気穿孔法に基づくmicroporation（Invitrogen 社製）でiPS 細胞に遺伝子導入を行なったところ、70%以上の細胞が遺伝子導入されたが、その後の薬剤選別による安定株取得は不可能であった。そこで、哺乳類細胞への遺伝子導入効率が非常に高いとされるPiggyBac 系をヒトiPS 細胞への遺伝子導入に適用したところ良好な結果が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、乳歯歯髄由来iPS細胞へのLEF-1 promoterの遺伝子導入と分化誘導実験の検討を予定している。
ⅰ）in vitro：歯構成細胞の分化には、未だ有効な分化誘導因子の報告はない。しかし、口腔組織由来の間葉系細胞（DPSCs などが含まれる）と表皮系細胞との共培養が有効１）とされるため、今回得られる組換えiPS 細胞の歯形成細胞への分化ポテンシャルを検討する手段として、共培養を選んだ。相手側の細胞には、マウス胎仔（d-14）の口腔部（歯原基の形成が盛んな時期で、表皮系細胞と間葉系細胞とが混在）の初代培養細胞を据える。この細胞と組換えiPS 細胞とを通常培地で共培養し、in vitro で歯形成細胞への分化が見られるか、蛍光マーカーを指標に分化レベルを検討する。この場合、細胞ミックスをハイドロキシアパタイトからなるscafold にくるませ、器官培養も行う。
ii）in vivo：細胞ミックスを単独あるいはscafoldにくるませ、免疫不全マウス皮下に移植する。移植後4、8 週目に採材し、蛍光マーカーを指標に組織学的に検討する。
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| Causes of Carryover |
遺伝子発現実験を行う予定で、数種類のプライマーを購入する予定であったが、文献にて確認するのに時間がかかり、平成２６年度内に発注することができなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
プライマーの排列を確認し、購入予定である。
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