2017 Fiscal Year Research-status Report
ＤＮＡ二本鎖切断モデルの構築と、それを用いた修復と低線量影響に関する研究
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25340044
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
本間 正充 国立医薬品食品衛生研究所, 変異遺伝部, 部長 (30250179)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | DNA修復 / 遺伝的不安定性 / 相同組み換え / BLMヘリケース |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ブルーム症候群(BS)は、低身長、紫外線感受性、不妊、がん体質を特徴とする遺伝性の早老症疾患の一種である。BLMヘリケース（BLM）は哺乳類細胞において組換え修復、特に組換え中間体であるホリデー構造の解離に関与しており、その異常は姉妹染色分体交換の亢進や、相同染色体間の相同組換え（HR）の異常をもたらし、遺伝的不安定性を引き起こすとされているが、その生物学的役割は明かではない。本研究ではBLMの役割を細胞遺伝学的に検討し、BSの病態メカニズムを明らかにすることを目的とする。
BSのモデル細胞としてBLMノックアウト細胞を作成し、BLMの遺伝的不安定性と、DSB修復への役割を解明した。ヒトリンパ芽球細胞TK6のチミジンキナーゼ(TK)遺伝子にI-SceIサイトを導入し、非相同組み換え（NHEJ）と、組換え（HR）を別々に評価しうるTSCE5と、TSCER2細胞を樹立した。これらの細胞にゲノム編集技術を用いてBLMノックアウト細胞であるBLM-TSCE5、BLM-TSCER2細胞を作成した。BLM-TSCE5細胞の自然突然変異頻度は正常細胞に比べて10倍以上も高く、DSB導入によりさらに顕著に増加した。一方、BLM-TSCER2細胞では、自然HR頻度の亢進と、交差型の遺伝子変換、非交差型の長い遺伝子変換、欠失が多く観察された。これらの事実から、BLMは、ホリデー構造の維持に関与し、その欠損はホリデー構造を不安定化させ、ゲノムの広範囲での欠失や組換えをもたらし、細胞のがん化を引き起こすものと考えられた。 本研究は、Molecular Cellular Biologyの2016年12月号に掲載された。BLMはGEN1、SLX4と複合体を形成し、ホリデー構造を安定化せせると考えられているため、ゲノム編集技術によりGEN1、SLX4ノックアウト細胞を作成し、TK自然突然変異頻度を検討したが、それら細胞ではBLMノックアウト細胞のようなゲノム不安定性は観察されなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目的は論文を完成させることにより4年目で達成したが、その後GEN1、SLX4ノックアウト細胞を用いた試験結果は予想通りの結果が得られていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
BLMヘリカーゼと相互作用し、組換え修復に関与していると考えられているGEN1、SLX4遺伝子のノックアウトとBLMノックアウトの2重、3重変異株をCRISPR/CAS9技術により作成し、遺伝的不安定性を検討する。また、また、ゲノム安定性、細胞周期チェックポイント、アポトーシスに深く間しているp53にも注目し、TSCE5、TSCER2細胞を用いてこれらノックアウト細胞を作成し、同様の研究を行い、ほ乳類細胞での組換え修復機構の研究をさらに推し進める。
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| Causes of Carryover |
昨年度は研究所の移転等で雑務に忙殺され、十分に研究ができず、また論文投稿、学会発表の機会も制限された。延長が認められた次年度に計画した研究を完了させ、論文化、学会発表のために使用する。
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