PAMPSゲルが誘導する多様な細胞分化において共通する酵素発現動態と機序の解明

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25350548
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 仙葉 愼吾 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (40466496)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安田 和則 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20166507) ; 津田 真寿美 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30431307)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 再生医工学材料 / 生体材料 / ダブルネットワークゲル / ハイドロゲル

Research Abstract

我々はマウス胚性腫瘍細胞（ATDC5細胞）を軟骨細胞に分化させる能力を有するPAMPS/PDMAAmダブルネットワークゲルを開発し、さらにPAMPS(poly(2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid))ゲルは他の様々な細胞に対して多様な分化誘導能を有する可能性があることを発見した。本研究の目的は、PAMPSゲルが誘導する多様な細胞分化現象において共通に変動する酵素を網羅的に解析し、これらの酵素の発現動態をリアルタイムに解析してその機序を明らかにすることである。今年度は、ATDC5細胞をPAMPSゲルと陰性対照としてポリスチレン（PS）ディッシュ上で培養したときのキナーゼの発現変化を網羅的に解析した。PAMPSゲル、PSディッシュ上で培養した細胞から抽出液を調製し、２次元電気泳動にてタンパク質を分離後、網羅的にキナーゼを認識するマルチキナーゼ抗体を用いたウェスタンブロットを行った。そしてシグナル強度の異なるスポットに注目し、その分子量と等電点からTagIdent検索プログラムを用いてキナーゼの推定を行った。さらに推定されたキナーゼに対する特異抗体を用いたウェスタンブロットを行い、実際にその発現が変動していることを確認した。その結果、キナーゼXの発現がPAMPSゲル上での培養によって変化していることが明らかとなった。このキナーゼXの活性はリン酸化によって調節されていることが既に知られているのでキナーゼXのリン酸化状態を調べたところ、PAMPSゲル上で培養するとそのリン酸化が大きく亢進していることが明らかとなった。今後はこのキナーゼXの活性調節メカニズムを明らかにすべく、DNAマイクロアレイを用いたtranscriptome解析を行うとともに、PAMPSゲルに特異的に結合する細胞接着分子の同定を試みる予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は、PAMPSゲルによって機能に影響をうけるあらゆる細胞には、その情報伝達機構に関する共通のシグナル分子が存在するのではないか?という着想に基づいている。平成２５年度では、PAMPSゲルによって軟骨分化が促進されることが既に明らかになっているATDC5細胞を用いて、PAMPSゲルが活性化する軟骨分化シグナル経路の同定することで「共通のシグナル分子」に対する知見を得ることをまず試みた。当該年度におけるポイントは次の２点である。（１）マルチキナーゼ抗体を用いたkinome解析の結果、PAMPSゲル上での培養で発現量が変動するキナーゼXを見いだすことができた。このキナーゼはATDC5の軟骨分化に関与していることが既に報告されている。また、予備的な結果ではあるが、このキナーゼの活性を阻害するとPAMPSゲル上のATDC5の軟骨分化が抑制されることを見いだしている。（２）PAMPSゲル上で培養したATDC5では、キナーゼXのリン酸化が亢進していた。これは、未だその機構が未解明であるPAMPSゲルによる軟骨分化誘導能を明らかにする上で重要な知見である。また、このリン酸化亢進はATDC5以外のほかの細胞種でも見られていることから、今回見いだしたキナーゼは「共通のシグナル分子」の候補の一つかもしれない。以上の２点から、kinome解析は当初の予定通り進行していると考えている。しかしながら、PAMPS分子が直接的にリン酸化を亢進させるとは考えにくいため、PAMPSゲルを用いたpull-downアッセイによってゲルと直接結合する細胞接着分子を同定し、ゲル-接着分子-キナーゼのシグナル経路を明らかにする必要性があると思われる。

Strategy for Future Research Activity

平成２６年度では、申請書に記載した計画通りにtranscriptome解析を行う。PAMPSゲル、PSディッシュ上に細胞をプレーティングして培養後、系時的にmRNAを回収する。予備的検討として、平成２５年度で同定したキナーゼ遺伝子の変動をリアルタイムPCRで解析し、発現変化が始まるタイミングを解析する。その結果をもとに全遺伝子の発現変動をDNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析し、PAMPSゲルによって発現が変動する遺伝子群を抽出する。抽出した遺伝子群に対してはリアルタイムPCRによってPAMPSゲル上での培養によるmRNAの発現変動を確認し、その遺伝子産物の機能と前年度で同定したキナーゼとの関連を検討する。また、PAMPSゲルと直接結合する細胞接着分子を同定する必要があると考えられたので、以下の実験を予定している。細胞表面タンパク質をbiotin標識した細胞から細胞膜画分を調製し、PAMPSゲルとavidin-Sepharoseを用いたpull-down法でPAMPSゲルに細胞接着分子を単離し、質量分析計による同定を試みる。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

消耗品にかかるコストを見直し経費削減に努めたことと、細胞培養に使う血清などの試薬類を既存のものを使うことができたことによる。
平成２６年度では、DNAマイクロアレイによる遺伝子発現変化の網羅的解析と質量分析によるタンパク質同定を予定している。解析にかかる時間的コストの削減や、再現性の高いデータを効率よく得るために専門業者への受託を予定しており、そのための費用にあてる。また、細胞培養や分子生物学的実験のために物品費として使用予定である。