2014 Fiscal Year Research-status Report
グルコース非依存的エネルギー産生機構による細胞生理機能の解明
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25350970
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
北口 哲也 早稲田大学, 重点領域研究機構, 准教授 (60432374)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
新井 敏 早稲田大学, 重点領域研究機構, 招聘研究員 (70454056)
坪井 貴司 東京大学, 総合文化研究科, 准教授 (80415231)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | GFP / ATP / 可視化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に開発したATP動態を可視化するプローブを培養細胞に導入した。このプローブは遺伝子コード型の蛍光タンパク質プローブであり、大腸菌より精製すると、ATP添加により５倍ほどの蛍光強度の増加が見られるプローブであった。本年度は、このプローブをHeLa細胞に導入し、細胞内におけるATP動態を検出できるかどうかを検討した。
このATPプローブをHaLa細胞で発現させると、大腸菌発現プローブを蛍光分光光度計で測定したのとほぼ同様の緑色の蛍光を発した。HeLa細胞の細胞質にATPプローブを発現させ、解糖系の阻害薬であるフッ化ナトリウムを添加したところ、顕著な蛍光強度の低下が観察された。このことより我々の開発したATPプローブは、細胞質におけるATP濃度の低下を検出できることが判明した。つまり、精製タンパク質だけでなく、動物細胞内におけるATP動態を可視化できるツールの開発に成功したと言える。
さらに遺伝子コード型であるメリットを生かして、細胞内小器官へのターゲットも試みた。ミトコンドリアターゲットシグナルを融合し、HeLa細胞に発現させたところ、ATPプローブはミトコンドリアに局在して発現していた。そこで酸化的リン酸化の阻害薬であるオリゴマイシンを添加したところ、ミトコンドリアに局在しているATPプローブは顕著な蛍光強度の低下を示した。このことより我々の開発したプローブは細胞質のみならずミトコンドリアにおいてもATP動態を可視化できることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ATPの動態を可視化するプローブの開発はすでに達成しており、本年度は培養細胞に導入することに成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
培養細胞に導入し、適用可能であることを示した。今後は生理的条件下でのATP動態を検討する。
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| Causes of Carryover |
初年度に研究機器として購入を予定していた顕微鏡を共通機器を使うことにより節約し、プローブ開発に注力したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額を利用して、プローブ開発により注力する。
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