2013 Fiscal Year Research-status Report
哺乳動物における植物内在性物質・ニコチアナミンによる鉄輸送の分子機構解明
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25350973
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Suntory Foundation for Life Sciences |
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Principal Investigator |
村田 佳子 公益財団法人サントリー生命科学財団, その他部局等, 研究員 (60256047)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
難波 康祐 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (50414123)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 鉄 / ニコチアナミン / 小腸吸収 / トランスポーター / 植物性食物 |
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| Research Abstract |
哺乳動物において、植物由来の鉄キレート化合物、ニコチアナミン(NA)による鉄の吸収・輸送に関連するトランスポーターが存在するとの仮説のもとに、これを同定することによって、全く新しい鉄輸送の分子機構を解明することを目指す。
①小腸吸収モデル細胞でのNAの鉄取り込みアッセイ：小腸吸収モデルであるcaco-2細胞におけるアッセイ系と培養物内のNＡのLCMS(LCMS8030, Shimadzu)による定量法をNAの末端アミノ基を9-fluoroenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)標識化して確立した。細胞にNAと鉄を同時に添加するとNAの濃度依存的に鉄の排出量が増加した。また、鉄を添加１時間後にNAを添加しても、鉄の排出量が増加した。Basal側でのNAを定量すると、鉄と同じ割合で排出していることから、NA-鉄錯体として輸送されていると考えられた。
②マウスでのNAの鉄取り込みアッセイ：マウスに鉄フリーおよびNA-鉄錯体を投与し、投与前、1, 2, 5時間後の血液、各組織の鉄、銅、亜鉛を測定した結果、NA-鉄錯体投与群が鉄フリー投与群より２時間後で胃と肺の鉄濃度がより高かった。しかし、銅、亜鉛も同じ傾向を示した。それに比べて、大腿筋ではNA-鉄錯体投与群が鉄フリー投与群より鉄濃度だけが５時間後に顕著に増加していた。この結果から組織特異的にNA-鉄錯体の取り込み効果があることが示唆された。
③トランスポーターの探索と機能解析：小腸上皮でのNAおよびNA鉄錯体の輸送候補タンパク質であるヒトPEPT1(Peptide transporter)およびDMT1 (Divalent Metal Transporter)をアフリカツメガエル卵母細胞に各々発現させ、電気生理活性実験を行ったが、NA, NA-鉄錯体、共に活性は見られなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
小腸吸収モデル細胞であるCaco-2細胞のアッセイ系,ニコチアナミン(NA)の定量法を確立し、その実験系を用いて添加するNAの濃度依存的に鉄の排出量が増加する結果を得た。また鉄を添加して１時間後にNAのみを添加しても鉄排出を促進した。この結果は腸モデル細胞でのNAまたはNA-鉄錯体トランスポーターの存在を示唆している。マウス実験ではNＡ-鉄錯体投与により、フリーの鉄投与より大腿筋に鉄濃度が増加しており、この組織での鉄輸送にNAが関与していると考えられた。植物のＮＡ-鉄錯体トランスポーターであるYSL (Yellow Stripe 1-Like)遺伝子がオリゴペプチドトランスポーターであることからヒト小腸でのNA-鉄錯体トランスポーターとしてPEPT1(Peptide transporter)を第一候補にしていたが、oocytesでの輸送活性は見られなかったが、他の関連遺伝子をoocytesに発現するベクターを作成し、活性を測定する準備を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
NAおよびNA-鉄錯体のMALDI(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) MSによる分子イオン検出法が確立できたので、NAまたはNA-鉄錯体を投与したマウスの小腸および筋肉でのImaging MSおよびMS/MS解析を試みる。この結果により、マウス組織でのこれらの吸収を可視化できると期待している。また、NA-Fe錯体の構造をMS,NMRから解析する。
NAまたはNA-鉄錯体トランスポーターを同定するため、発現ベクターの準備ができたSLC (Solute Carrier)グループの候補タンパク質のoocytes活性測定を行う。さらに、候補遺伝子を探索するために、アスコルビン酸（As）のみ、As+鉄(Fe)、As+NAまたは As+Fe+NA を投与したcaco-2細胞や、同混合物投与後のマウス小腸のRNAを、定量PCRや次世代シークエンサーMiSeqで解析する。ここで得られた候補遺伝子の局在を調べ、さらに鉄輸送活性を測定する。
NAの合成標識体およびアイソトープ鉄をマウスおよびcaco-2細胞、腸オルガノイド（腸上皮組織構造体）に取り込ませ、その輸送、蓄積、代謝を観察する。
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