2014 Fiscal Year Research-status Report
癌におけるPTENリン酸化異常の分子機構とその役割の解明
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25430113
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
中畑 新吾 宮崎大学, 医学部, 助教 (80437938)
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2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | PI3K/AKT / 阻害剤 / SCYL2 / PTEN / リン酸化 / NDRG2 / ATL |
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| Outline of Annual Research Achievements |
成人T細胞白血病(ATL)のゲノム解析から単離したNDRG2は、PTEN結合タンパク質であり、PP2Aホスファターゼを介してSer380/Thr382/Thr383 (STT)リン酸化を抑制し、PI3K/AKT経路を抑制する。ATLにおけるNDRG2発現低下は、PTEN-STTリン酸化を亢進し、PI3K/AKTの恒常的活性化を誘導する。NDRG2は、PI3Kの標的であるSGK1によりリン酸化されることから、NDRG2を介したPTENリン酸化調節がPI3K経路の負のフィードバック経路の一つとして働くことが示唆される。NDRG2は、低酸素誘導遺伝子であることから、今回、ATLにおけるNDRG2発現低下と低酸素ストレス応答の制御異常との関連について検討した。
正常細胞由来HaCaTを用いて、低酸素処理がNDRG2発現およびSGK1によるNDRG2 Ser332のリン酸化を増加させ、PTEN-STTリン酸化、AKT活性化を低下させることがわかった。一方、ATL細胞株や、神経芽細胞腫SK-N-SH等の癌細胞株では、NDRG2はプロモーターメチル化等のエピジェネティック変化により発現低下しており、低酸素によるNDRG2発現の誘導はみられない。実際これらの細胞株では、低酸素においてもPI3K/AKTの活性化は高く、PTEN-STTリン酸化も亢進していた。また、ATLでは、SGK1のリン酸化が亢進していることを見出し、ATL細胞は、NDRG2を不活化することで、低酸素による増殖抑制を回避している可能性が示唆された。
PTENリン酸化の機序としては、SCYL2の高発現がPTEN-STTリン酸化の亢進に関与することから、SCYL2のキナーゼ活性およびSCYL2を活性化する上流シグナル経路について検討を行った。KK1-ATL細胞抽出液より精製したSCYL2は、in vitroにおいて有意な活性を示し、SCYL2がPTEN-STTのリン酸化を担っていることが示唆された。また、エンドサイトーシスの被覆小胞に関わるSCYL2結合タンパク質クラスリンの高発現がPTEN-STTリン酸化の亢進に関わることを見出し、SCYL2阻害剤はATL細胞の有望な分子標的となる可能性が考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度において、NDRG2によるPTEN-STTリン酸化制御を解明することを目的に、PI3K経路の負のフィードバック経路としての役割に着目して、シグナル伝達経路およびそのフィードバック調節の異常による細胞機能への影響を中心に解析を行った。
NDRG2/PP2Aによる PTEN-STTの脱リン酸化は、PI3K/AKT経路の負のフィードバック経路を介して起こり、その機序として、PI3K活性化は、PDK1によるSGK1の活性化を誘導し、活性化されたSGK1がNDRG2 Ser332をリン酸する。このNDRG2 Ser332のリン酸化は、NDRG2とPP2Aの会合を促進させ、NDRG2に結合するPTENにPP2Aがリクルートされ、PTEN-STT脱リン酸化の促進、PTENの活性回復により、PI3K/AKT活性化が抑制されることが明らかになった。一方、NDRG2は低酸素等の細胞ストレスにより発現誘導される遺伝子で、癌細胞は低酸素ストレスにおいて抵抗性をもち、癌の発達、転移に関与することから、低酸素応答におけるPTEN-STT脱リン酸化制御について解析した。その結果、ATL細胞はNDRG2発現低下により、低酸素刺激によるPTENの脱リン酸化およびAKT活性化の抑制がなくなり、低酸素による増殖抑制を回避できる可能性が示唆された。多くの癌においてNDRG2の発現低下は、PTEN脱リン酸化の制御異常を介して、細胞増殖や細胞ストレス時の生存に重要な役割を担っている可能性が考えられる。
また、PTENリン酸化を担う候補分子SCYL2の機能解析を行い、SCYL2活性化に関与する上流のシグナル分子として、SCYL2結合タンパク質クラスリンを同定した。キナーゼアッセイにより、SCYL2がPTENをリン酸化するタンパク質であることが示唆され、更なる解析によりPTENリン酸化を標的にした分子標的薬への応用の道筋がつけられるものと思われる。以上は、本年度の研究課題について概ね成果を得たものと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
ATLにおけるSCYL2の高発現および活性化の分子機構を明らかにし、PTEN-STTリン酸化の制御異常の分子機序の全貌を明らかにする。SCYL2の上流シグナル分子として、クラスリンの関与が明らかになったことから、上流レセプターやSCYL2の活性化を担うキナーゼ等の分子機序を明らかにし、PTEN-STTリン酸化を導くシグナル伝達経路を明らかにする。
SCYL2阻害剤は、PI3K/AKT経路の効率的な分子標的薬として、またATLの新規治療薬として可能性があることから、SCLY2阻害剤のスクリーニング系を確立し、化合物ライブラリーのスクリーニングを行う。SCYL2タンパク質をバキュロウイルス発現系により作製し、PTEN-STTペプチドを基質に、ADP-Gloキット（promega）を用いてキナーゼ活性を検討する。これまでの解析からSCYL2は、細胞内でリン酸化修飾を受けておりSCLY2キナーゼ活性に関与することが示唆された。現在、これらリン酸化の機能解析を行っており、疑似リン酸化変異体の作製等、活性型のSCYL2タンパク質を精製する。化合物スクリーニングにより得られた候補化合物について、細胞増殖やPI3K/AKT経路の抑制効果等について検討する。
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| Causes of Carryover |
動物実験に関わる支出が当初の計画額より抑えられたため、未使用分110,000円が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
化合物スクリーニングの解析に必要な試薬代に計上する予定である。
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[Journal Article] Development of a complete human anti-human transferrin receptor C antibody as a novel marker of oral dysplasia and oral cancer.2014
Author(s)
Nagai K, Nakahata S, Shimosaki S, Tamura T, Kondo Y, Baba T, Taki T, Taniwaki M, Kurosawa G, Sudo Y, Okada S, Sakoda S, Morishita K
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Journal Title
Cancer Medicine
Volume: 3
Pages: 1085-1099
DOI
Peer Reviewed
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