2014 Fiscal Year Research-status Report
葉緑体光定位運動におけるCHUP1シグナリング複合体構成因子の解析
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25440140
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
孔 三根 九州大学, 理学(系)研究科(研究院), 特任助教 (70514157)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 葉緑体運動 / 青色光 / 光受容体 / フォトトロピン / アクチン繊維 / 信号伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
葉緑体は、時々刻々変化する自然光環境下で、青色光の強度と方向を常に認識しながら細胞内の最適な場所に速やかに移動する。細胞膜と葉緑体外包膜間に局在するCHUP1複合体のダイナミック、かつ可逆的な局在変化は、葉緑体の細胞膜への定着とcp-actin依存的葉緑体運動の制御に必須である。本年度は、CHUP1複合体の構成因子間の相互作用、生理機能、およびphot2を介したリン酸化について以下の解析を行った。
１．CHUP1の新規複合体因子CHIP1の機能解析：葉緑体の細胞膜へのアンカーに必須のCHIPの詳細な分子機構をシロイヌナズナで解析するためには、CHIP1ホモログの欠損変異体が必要である。そこで、CRISP/Cas9システムを用いてCHIP1ホモログであるCHIL1, CHIL2のノックアウトの構築を試みた。それぞれ30-50ラインのT2世代についてノックアウトを探したが、CHIP1ホモログの多重欠損変異体は未だ得られてない。形質転換体のwestern blot解析から、Cas9の低い発現量がその原因である可能性が示唆された。
２．CHUP1複合体因子の相互作用：CHUP1複合体因子のphot2依存的相互作用を確かめるため、chip1変異体にCHIP1-GFPとCHIP1-RFP遺伝子を導入した形質転換体を作製し、内在性CHIP1タンパク質並みの発現量を示すラインを選抜した。詳細な生理応答と細胞内局在の変化については実験中である。また、タンパク質因子間のin vitroにおける相互作用を調べるために、CHUP1複合体因子の組み替えタンパク質の精製条件を検討した。
３．CHUP1複合体因子のリン酸化制御：phot2の基質であるTHRUMIN1とCHIP1のphot2特異的リン酸化サイトに変異を導入し、リン酸化の不活性型及び活性型の形質転換体を作出した。現在、T3世代のホモラインの選抜を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究により、CHUP1の細胞膜への結合に必要なタンパク質（CHIP1）を同定したこと、CHUP1複合体の構成・解除にはphot2を介した青色光依存的リン酸化と未知のフォスファターゼによる脱リン酸化が必要であること、リコンビナントタンパク質を精製したことなど、CHUP1複合体の分子機構の解析は順調に進んでいる。CHIPホモログの多重変異体の作製は遅れているが、全体的には計画した研究が順調に進行していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
CHUP1の細胞膜との結合、細胞膜からの離脱、葉緑体外包膜上の移動の３過程について、CHUP1複合体因子、特にCHIP1とKACを個別に解析し、その機能を明らかにする。リン酸化・脱リン酸化を介したCHIP1とKACのCHUP1との結合・離脱には、CHUP1とCHIP1のドメイン同士の結合部位の解明が必須であるので、in vitro実験により分子間相互作用を確定し、さらに結晶構造解析を行う。
CHIP1とTHRUMIN1のリン酸化サイトをアラニンもしくはアスパラギン酸に置換した形質転換体を用いて、CHIP1とTHRUMIN1の青色光依存的細胞内局在と生理応答について詳細な機能解析を行う。
CRISP/Cas9を用いたCHIPホモログの欠損変異体の作製では、Cas9のwestern blot解析によれば、Cas9が検出できないほど、発現量が低かったことから、高発現ベクターあるいはTALENを用いて再実験を行う。
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| Causes of Carryover |
今年度末に研究室の移動に伴い、計画した一部の実験が実行出来なかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
移動した新しい研究室で引き続き計画研究を実行する。
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