2013 Fiscal Year Research-status Report
ミトゲノム解析と核マーカータイピングによる日本産ハブ属3種の遺伝的集団構造の研究
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25440214
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
柴田 弘紀 九州大学, 生体防御医学研究所, 准教授 (80315093)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
千々岩 崇仁 崇城大学, その他部局等, 准教授 (30331060)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 遺伝的多様性 / ハブ / 系統地理学 / ミトゲノム / マイクロサテライトマーカー |
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| Research Abstract |
本年度は、以下の3つを進めた。1は研究計画全体の推進に必須なステップであり、2と3は申請書における研究計画1（集団間の分化の解析）に該当する。
1. [検体整備]：ハブについては9島から合計400個体以上を収集できた。特に沖縄本島産については、沖縄県衛生環境研の協力のもとGPS情報付き個体の収集をかなり進めることができた。トカラハブについても2島から合計50個体以上を収集した。サキシマハブについては2島から9個体を収集した。
2. [ミトゲノム解析]：奄美大島、徳之島、沖縄本島、伊平屋島、伊江島、久米島の6島のハブ各4-5個体、小宝島のトカラハブ4頭、および石垣島、西表島のサキシマハブ各1頭のミトゲノム配列を決定し最尤法による解析を行った。その結果ハブは, 北部個体群（奄美大島, 徳之島）からなる奄美クラスターと, 南部個体群（沖縄島, 伊平屋島, 久米島）からなる琉球クラスターの2群に遺伝的に分化していることが分かった. また, トカラハブは奄美クラスターに完全に含まれた. 以上のことから, 現在ハブとされる種の島集団間の遺伝的多様性は大きく, 現在別種とされるトカラハブはその多様性の中に完全に収まるため, トカラハブのみを独立種とすることの妥当性は低いと考えられた.
3. [マイクロサテライトマーカー解析]：ハブのマイクロサテライトマーカーの単離を進めた。全ゲノムショットガンリード10 Gbを新規アセンブルして得た全長1.5Gbのコンティグから、情報学的手法により、マイクロサテライトの候補となる繰り返し領域の配列を合計1万本以上同定した。ここから十分な多型性を示すマイクロサテライトマーカーを20個単離できた。また全自動シークエンサで断片長解析を行うために通常のPCRで増幅した産物を蛍光標識する手法（ポストラベリング）の最適化を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ミトコンドリアDNAの解析が非常にシステマティックに勧められる体制ができており、計画1のミトゲノム解析については問題なくデータの収集が出来ている。またその過程において、多型性の高い（=情報量の多い）領域を5kb選別できたので、計画2もミトゲノム解析については順調に進んでいる。一方マイクロサテライトマーカーの整備については、ポストラベリングの手法の開発／最適化に手間取ったため、当初の予定よりやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. [検体整備]：まだ十分な検体数の得られていない地域／集団の検体収集を、研究協力者の服部正策（東大医科研）および寺田考記（沖縄衛生環境研）とともに進める。特に26年度は、サキシマハブ、トカラハブの採集に力をそそぐ。また主要な10島についてはGPS情報などを参考に、研究計画2の集団内多様性検出に用いる検体セットの整備を進める。
2. [ミトゲノム解析]：ハブの生息する全ての島から各2-3個体についてミトゲノム全長を決定する（研究計画1に対応）。本年度は、入手済の宝島、渡嘉敷島、古宇利島、屋我地島の検体の解析を進める。さらに、今年度のミトゲノムの解析から多様性の高い（=情報量の多い）ことを確認した領域5 kbについて、計画2のために選択した検体セットについてのデータを取得する。
3. [マイクロサテライトマーカー解析]：これまではPCR産物の蛍光標識（ポストラベリング）を、蛍光標識済みのジデオキシUTPを用いたKlenowの交換反応で行って来たが、上述のようにプライマーの設計に手間取るため、当初の予定よりやや遅れていた。今年度は、M13配列を5’端に付加した特異的プライマーと蛍光標識済のM13プライマーを共存させてPCRを行うことで、最終的なPCR産物を標識する方法の最適化を進める。これによりマイクロサテライトタイピングの高速化と低コスト化を図る。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当初の予定通り試薬を購入したが、一部の試薬が予定より安かったため。
消耗品（試薬）を購入する。
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[Presentation] The transcript catalogue for the venom gland of Protobothrops flavoviridis snake in Amami-Oshima, Japan.2013
Author(s)
Oda-Ueda N, Nakamura H, Shibata H, Mori K, Tashiro K, Kuhara S, Chijiwa T, Fukumaki Y, Ohno M.
Organizer
XI Congress of the Pan-American section of the International Society on Toxinology
Place of Presentation
São Paulo, Brazil.
Year and Date
20131103-20131107
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