2013 Fiscal Year Research-status Report
カバノアナタケ菌に感染したシラカンバ幼植物体に生成する特異的タンパク質の画像解析
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25450204
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Utsunomiya University |
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Principal Investigator |
横田 信三 宇都宮大学, 農学部, 教授 (60210613)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上高原 浩 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (10293911)
吉永 新 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (60273489)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | シラカンバ / カバノアナタケ / ペルオキシダーゼ / MALDI/TOF/MSイメージング / 樹病 |
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| Research Abstract |
本年度の研究では、癌腫病菌カバノアナタケIO-U1株に感染した、３ヶ月生及び６ヶ月生シラカンバ幼植物体No.8に発現する、菌感染特異的ペルオキシダーゼの組織内分布を、酵素活性染色及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化ー飛行時間型質量分析法 (MALDI/TOF/MS) イメージング解析法を用いて検討した。
３ヶ月生のシラカンバ幼植物体を、３ヶ月間培養し、６ヶ月生の植物体を調製した。この植物体苗長の1/5の基部付近に傷を付け、ここにカバノアナタケIO-U1株の菌糸体を接種した (T)。対照として、無傷・無菌(C1)及び有傷(C2)の植物体も用意した。各処理後、植物体を2, 10, 30日間培養し、各植物体を収集して処理部を採取した。これに、ペルオキシダーゼ活性染色、またはフェノール性化合物呈色反応を施し、横断面切片を作成後、光学顕微鏡で観察した。３ヶ月生の幼植物体についても、C1, C2, Tを調製し（処理部は茎頂から３番目の節間）、2, 10, 30日間培養した。培養後、各植物体を収集して第３節間を採取した。これを液体窒素で凍結し、横断面切片を作成した。この切片を用いて、MALDI/TOF/MS及びイメージング解析 を行った。イメージングに使用したマススペクトルピークは、次の通りである。m/z 11000±1000, 10700±1000, 22000±1000, 22100±1000, 27000±1000, 27500±100, 32000±1000, 31900±100, 40000±1000, 40300±100, 60000±1000, 59900±100, 69600±100。
３ヶ月生の幼植物体の場合と比較して、６ヶ月生の植物体は、より発達した菌に対する防御応答（ペルオキシダーゼの発現、フェノール性化合物の堆積）を示すことが判明した。また、MALDI/TOF/MS イメージング解析の結果、菌感染特異的ペルオキシダーゼアイソザイムは、木部において全体的に分布していることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
３ヶ月生の幼植物体からの凍結横断面切片の作成において、作成後の切片中の組織が分離する問題に直面している。また、２つ目の対象タンパク質である、微小管構成タンパク質の抽出がうまく進んでいないからである。
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| Strategy for Future Research Activity |
凍結切片の作成については、様々な手法を試みるつもりである。また、微小管構成タンパク質の抽出については、微小管研究の専門家に相談する予定である。更に、微小管の画像解析については、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いることも検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
今年度の研究において、３ヶ月生シラカンバ幼植物体の横断面切片の作成を、なかなかうまく行うことが出来ず、結果的に、横断面切片を用いたMALDI/TOF/MSイメージング解析を、計画通りの回数行うことが出来なかった。そのため、MALDI/TOF/MSイメージング解析に使用する器具や試薬等をあまり購入せず、残金が出る結果となった。
次年度においては、３ヶ月生シラカンバ幼植物体の横断面切片の作成に関して、様々な手法を応用し、うまく切片作成が行えるよう試みる。また、6ヶ月生の植物体については、既に比較的うまく切片作成が行えているので、こちらの切片を用いて、MALDI/TOF/MSイメージング解析を先ず進めていく予定である。従って、今年度の残金及び次年度予算を併せて、この解析に必要となる器具、実験器具や試薬等の購入に使用する予定である。
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Research Products
(2 results)
