2015 Fiscal Year Research-status Report
「細胞内発現する人工小型抗体」封入ナノ粒子の血中投与による狂犬病治療法の開発
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25450439
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
加来 義浩 国立感染症研究所, その他部局等, 研究員 (70392321)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 狂犬病 / 遺伝子治療 / scFv / ドラッグデリバリー / 血液脳関門 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
狂犬病は、狂犬病ウイルス（Rabies virus: RABV）を原因とする人獣共通感染症である。ひとたび発症すると確実な治療法はなく、致死率はほぼ100%である。本研究は、RABVに対する人工小型抗体をRABV感染細胞に導入して、RABVの増殖を阻害することにより、狂犬病の治療法への応用を目指している。H27年度には以下の3項目に関して研究を行った。
１）抗RABV-PscFvのエピトープマッピング：RABV-Pの全アミノ酸配列に基づくペプチドセットを固着させたガラススライド上で、scFvを反応させ、マイクロアレイで検出することにより、RABV-Pとの結合部位を明らかにすることを目指している。Linear epitopeを認識することが確認されている抗RABV-P scFv 4クローンについて解析を行い、epitopeの候補部位を明らかにした
２）血液脳関門（BBB）透過性ペプチドを用いたin vitroデリバリー系の構築：RABV-G蛋白質由来のペプチド29残基（RVG29）を血中に投与すると、BBBを越えて広範囲の脳実質へ移行することが報告されており、すでに脳への薬剤デリバリーの研究に応用されている。RVG29のほかに、同様にBBB透過性が報告されているヘビ毒由来ペプチドKC2S、陰性対照ペプチドについて、抗RABV-G血清に対する反応性およびscFv発現ベクターとの結合性の解析を行った。さらに上記ペプチドを用いたscFv発現ベクターのin vitroデリバリー系を構築し、デリバリー効率を検証した。
３）血液脳関門（BBB）透過性ペプチド外套ナノ粒子を用いたin vitroデリバリー系の構築：上記BBB透過性ペプチドを表面に外套したナノ粒子を作製し、scFv発現ベクターの神経細胞特異的なデリバリー系の構築を目指している。まずBBB透過ペプチドを外套させず、細胞指向性を持たないナノ粒子を用いて、luciferase（LUC）またはGrenn fluorescent protein（GFP）発現ベクターのin vitroデリバリー系の構築および導入効率の検証を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
上述の3項目のうち「２）血液脳関門（BBB）透過性ペプチドを用いたin vitroデリバリー系の構築」については、2種類のBBB透過性ペプチドおよび1種類の陰性対照ペプチドを用いて研究を進めた。これらのペプチドを固相化し、抗RABV-G血清を用いてELISAを行った結果、同血清中病患者体内で阻害される可能性は低いと考えられた。またscFv発現ベクターとペプチドの混合比を段階的に変えて、DNA shift assayを行い、各ペプチドについて適切な混合比を決定した。この結果をふまえて、scFv発現ベクターと各ペプチドの複合体を作製し、マウス神経芽腫細胞に対する導入試験を行ったところ、導入効率は数%にとどまっていた。現在、導入効率の上昇を図るため、コントロールベクターとしてGFP発現プラスミドを用い、諸条件の再検討を行っている。また、BBB透過性ペプチド単独でのデリバリー効率が上昇しなかった場合を考えて、後述の上記ペプチドを外套したナノ粒子によるデリバリーの検討を開始した。
「３）血液脳関門（BBB）透過性ペプチド外套ナノ粒子を用いたin vitroデリバリー系の構築」については、予備実験として、細胞指向性を有さないナノ粒子とLUCあるいはGFP発現ベクターを混合し、マウス神経芽腫細胞へのin vitroデリバリー実験を実施した。その結果、細胞内への導入は確認されたものの、導入効率が著しく低かった。ベクターのナノ粒子への取り込み効率が低いことが一因と考えられたことから、ナノ粒子の組成から再検討を行っている。当初の計画では「ナノ粒子を用いたin vivoデリバリー系の構築」についても実施することにしていたが、in vitroデリバリーの効率が低かったことから、in vivoデリバリーへの応用を延期した。そのため、研究機関を１年延長し、In vitroでの高い導入効率を達成したうえで、in vivoの実験を行うこととした。
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| Strategy for Future Research Activity |
「抗RABV-PscFvのエピトープマッピング」については、すでに明らかにしたエピトープ候補部位のdeletion mutantを用い、Western blotting等で検証を行う。
血液脳関門（BBB）透過性ペプチドを用いたin vitroデリバリー系の構築については、導入効率の向上を図るため、GFPあるいはLUC発現ベクターを用いて諸条件の検討を行う。条件設定後、scFv発現ベクターを用い導入／発現効率を検討したうえで、導入細胞にRABVを接種し、増殖阻害効果を検討する。また、BBB透過性ペプチド外套ナノ粒子を用いたin vitroデリバリー系の構築についても、上記と同様の手順で検証を行う。
In vitroでRABV増殖阻害効果が確認できたデリバリー系およびscFvクローンを組み合わせて、in vivoデリバリー系の構築を行う。ペプチド／ナノ粒子およびscFv発現ベクター複合体をマウスの静脈内あるいは腹腔内に投与し、脳におけるscFv発現を解析することにより、脳へのデリバリー効率を確認する。脳へのデリバリーが確認できたクローンについては、scFv導入時にRABVを接種し、scFv導入／非導入マウス間で、発症効率を比較する。
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| Causes of Carryover |
本年度より、ナノ粒子によるin vitroデリバリー系の構築を進めるため、BBB透過性ペプチドを外套したナノ粒子の作製費用を計上していた。しかし、予備実験としてペプチドを外套せず細胞指向性を有さないナノ粒子を用いることとなり、同ナノ粒子については、ナノ粒子作製を委託した研究機関の試作品を利用することとなったため、会計手続きが発生しなかった。このため、研究期間を１年間延長し、BBB透過性ペプチドを外套したナノ粒子の作製費用を次年度に繰り越した。
またin vivoデリバリー系の構築を進めるため、マウスへの接種試験を行う計画であったが、in vitroデリバリーによる導入効率に改善の余地があったため、in vivoデリバリーの実施を延期した。このため、研究期間を１年間延長し、マウスの購入費用を次年度に繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ナノ粒子によるin vitro／in vivoデリバリー系の構築を目的として、BBB透過性ペプチドを外套したナノ粒子の作製費用およびマウスの購入費用等に使用される。
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