2013 Fiscal Year Research-status Report
配偶子間認識に関与する卵膜マトリクスの形成機構と精子側分子との相互作用機構の解明
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25450520
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Meijo University |
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Principal Investigator |
奥村 裕紀 名城大学, 農学部, 准教授 (60513661)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 組換えタンパク質 / タンパク質間相互作用 / ファーウエスタンブロッティング / pull-down 解析 / 免疫蛍光顕微鏡観察 |
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| Research Abstract |
平成 25 年度の研究では、交付申請書の「研究実施計画」に記載した通り、まずニワトリ 卵膜の採取と ZP1-ZP3 複合体と ZPD の分離、ゲル濾過クロマトグラフィーによる ZP1 と ZP3 の分離を行った。また、ZP1 の trefoil domain、ZP3 の N-terminal peptide および ZPD の EGF-like domain のそれぞれに対し、pET32 発現プラスミドと大腸菌発現系を用いて Trx/His-tag 融合タンパク質を作製し、それらを抗原としてマウスを免疫して新たな anti-ZP1, anti-ZP3, anti-ZPD ポリクローナル抗体を調製した。
本年度はまた、産卵鶏の血液中に含まれる ZP1 がどのようにして卵膜に組込まれるのかを解明する研究の一環として、前年度までに作製した組換え ZP3 および組換え ZPD をプローブとしてニワトリ血清に対する pull-down 解析を行った結果、血液中の ZP1 は ZP3 または ZPD の分子のどの領域と強く相互作用するかが明らかとなった。さらに、卵膜および上述のように卵膜から粗精製された ZPD に対して非還元条件の SDS-PAGE を行い、ポリアクリルアミドゲル内からニトロセルロース膜上に転写された ZP1, ZP3 および ZPD に対して、前年度までに作製された組換え ZP 糖タンパク質を反応させたところ、ZP1, ZP3 および ZPD がそれぞれどの分子内領域で相互作用し合っているかを示唆する実験結果が得られた。 なお、ニワトリ卵膜に対し、上述のポリクローナル抗体を用いて免疫蛍光染色し、卵膜マトリックスの構造の詳細を観察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請書に記載した平成 25 年度分の実験計画が順調に進行し、平成 26 年度に実施する予定だった内容も一部行うことができた。平成 25 年度に完了する予定であったニワトリ血清からの ZP1 の分離・精製については、まだ成功していないが、ニワトリ血清に対する pull-down 解析を行う過程で、血清から ZP1 を効果的に粗精製するために利用できると期待される方法が見出されたため、一定の進展は見られたと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成 25 年度の研究で一部前倒しして行った、卵膜の形成時および卵膜内における ZP 糖タンパク質間の相互作用の解析をさらに進行させる。例えば、二次元電気泳動によって分離された ZP3 異性体のスポットと他の ZP 糖タンパク質との親和性について解析し、また、ZP3 との相互作用前後における ZP1 の変化を詳細に解析する。卵膜の免疫蛍光顕微鏡観察については、精子との相互作用による卵膜の形態変化などの観察を行う。
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