2014 Fiscal Year Research-status Report
肥満細胞脱顆粒過程のイメージングと遺伝子機能解析への応用
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25460274
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
東尾 浩典 岩手医科大学, 教養教育センター, 講師 (50342837)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 洋一 岩手医科大学, 医学部, 教授 (40118253)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 肥満細胞 / マスト細胞 / 脱顆粒 / 調節性分泌 / Rab GTPase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
[1] 前年度同定した脱顆粒関連分子Rab37の機能を引き続き解析した。Rab37は小胞輸送を制御するRabファミリー低分子量GTPaseの一つであり、マスト細胞の分泌顆粒上に存在している。そのノックダウンによる著しい脱顆粒亢進、また脱顆粒を正に制御する既知の分子との結合から、Rab37は脱顆粒を負に制御する分子であると想定された。今年度はRab37とその脱顆粒を正に制御する分子との結合を生化学的手法により詳細に検討した。その結果、Rab37と当該分子がGTP非依存的に結合すること、当該分子は2カ所でRab37と結合しうること、またRab37と当該分子を含んだ脱顆粒関連分子複合体が形成されることを見出し、Rab37は脱顆粒を正に制御する分子のはたらきを直接抑制していることが強く示唆された。
[2] 前年度から取り組んできた肥満細胞脱顆粒のライブイメージング系の立ち上げが一段落したため、今年度はラット腹腔肥満細胞および肥満細胞株RBL-2H3を用いて細胞膜―分泌顆粒間、そして分泌顆粒―分泌顆粒間の膜融合が組合わさった分泌現象 (compound exocytosis)の時空間的解析を進めた。その過程で、分泌刺激の種類や強度によらず、刺激への応答性が細胞毎に大きく異なることが判明した。このイメージング系は脱顆粒に関与する遺伝子群を時空間的に機能解析することを目的としており、時空間的解析の結果を定量的に表現することが必須である。そこでどのような表現が妥当であるか検討した。
一方で、脱顆粒に関与する遺伝子群を網羅的にノックダウンするためのsiRNAベクター群を構築し、RBL-2H3細胞内でのノックダウン効率を確認して時空間的解析に供する準備を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Rab37の機能解析結果について論文を書き投稿したが、注文が多数付されて却下された。別の雑誌へ投稿しても同様の注文が付される可能性があるため、指摘された箇所の修正およびデータの追加を大幅に行っている。追加実験に多大な時間を割かれており、イメージング系の実験進行が遅延する結果となっている。
また、脱顆粒イメージングの時空間的解析結果の定量的表現の妥当性検証に時間を費やした結果、イメージングの遺伝子機能解析への応用が遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
[1] 新規脱顆粒関連分子Rab37については追加実験を終えたので、早急に論文を書き投稿する（早期受理を最優先した投稿雑誌選択とする）。
[2] 脱顆粒イメージングの時空間的解析結果の定量的表現にメドがつき、また既に脱顆粒関連遺伝子のノックダウン用プラスミドもほぼ完成しているので、今年度中に網羅的な解析は完了可能と考えられる。
[3] 肥満細胞の脱顆粒はCa2+依存的な調節性分泌である。そこで当初、イメージングにおいて脱顆粒を様々な分泌刺激を与えて解析し、また脱顆粒と細胞内Ca2+濃度変動との連関も同時に解析していく計画であった。しかし、達成度の遅れを鑑みて、まずは分泌刺激を1種類（抗原刺激）のみに固定し、またcompound exocytosisの様式・形態的特徴・タイムコースに関してのみ検討することとし、脱顆粒関連遺伝子の網羅的解析を完了させることを優先する。
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| Causes of Carryover |
概ね計画通りの執行状況である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
概ね計画通りの執行状況である。
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