ラット胎生初期の心臓原基におけるカルシウムトランジェントと収縮の関連

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25460295
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 小林 武志 札幌医科大学, 医学部, 講師 (80363688)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 當瀬 規嗣 札幌医科大学, 医学部, 教授 (80192657)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: rat / heart primordium / E-C coupling / calcium transient / α-cardiac actin / troponin-C

Outline of Annual Research Achievements

昨年度、心拍動開始前後のラット胎仔では、心臓原基にα-cardiac actinの発現が認められることをwhole mount 免疫染色法（発色法）にて確認していた。しかし、蛍光色素が結合した２次抗体を用いて共焦点顕微鏡にて観察する方法（蛍光法）では、発色法では認められなかった非特異的な蛍光を認めていた。今年度はまずその差異の解決を目指し実験を行った。検討の結果、１）１次抗体のロット違い、２）２次抗体作成時の抗原の違い、３）抗体の溶媒の組成の差異、の３つに原因があることが判明した。この結果を踏まえ実験条件を最適化して行った結果、α-cardiac actinの発現は心臓原基にほぼ特異的だと言うことが判明した。ただし、心拍動開始前の胎仔においては、心臓原基以外での染色も若干観察された。α-cardiac actinの発現は心臓原基の尾側に比べ頭側でやや発現が弱かったため別の内部標準蛋白質を確定しておく必要があると考え、troponin-C、PECAM-1、fibrillin-1、Flk-1、Notch-1、NFATc1、fibronectinの発現確認を行ったところ、troponin-Cが心臓原基に特異的に発現していることが観察された。α-cardiac actinと異なり、troponin-Cの発現は心臓原基の部位による差があまり認められなかった。そこで、α-cardiac actinとtroponin-Cの両者を用いた２重染色によるwhole mount 免疫染色法にて心拍動開始前後のラット胎仔の心臓原基での発現を観察したところ、心拍動開始前のcardiac crescentと呼ばれる心臓原基から心拍動開始後のlinear cardiac tubeと呼ばれる心臓原基に至るまでの心臓の形態変化が確認された。この時期のα-cardiac actinは主に細胞辺縁部に多く発現しており、細胞内発現の局在差があまり無いtroponin-Cの発現と異なっていた。