2013 Fiscal Year Research-status Report

動物接種とゲノム解析の組み合わせによる画期的な難同定病原微生物診断法の開発

Research Project

Project/Area Number	25460692
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	University of Miyazaki
Principal Investigator	岡山昭彦宮崎大学, 医学部, 教授 (70204047)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	林哲也宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 教授 (10173014) 高城一郎宮崎大学, 医学部, 講師 (20418841) 越本知大宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 教授 (70295210)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	感染症 / 新規診断法 / レーザーマイクロダイセクション法
Research Abstract	肺炎や菌血症のようにコモンな感染症であっても、その起炎菌の同定率は低い。これは感染症の原因が多彩であり、嫌気性菌や抗菌薬の影響、細胞内寄生体で培養困難な感染症の頻度が高いことによる。本研究においては古典的なグラム染色、培養法に加えて菌体成分をスライド標本からレーザーマイクロダイセクション (LMD) 法を用いて、直接回収し、細菌あるいは真菌の16sリボゾーマルRNA(16SrRNA)遺伝子を増幅する方法を確立し菌種同定に応用する。さらに免疫不全マウスなどをふくめた動物への検体接種を組み合わせることにより一般に困難な細胞内寄生体の検出も試みる。本方法の応用により病原体診断率の飛躍的向上を目指す。平成25年度においてはまずLMD法による最近の遺伝子診断法の確立を目指して、通常の細菌（大腸菌）を培養後階段希釈し、1-100細菌レベルでグラム染色塗沫標本を作成し、LMD法による菌体の切り出し、核酸抽出、nested PCR法を用いて16SrRNA遺伝子の増幅を試みた。この方法により数十個程度の菌体からは目的とする細菌由来の遺伝子の検出が可能であったが、それ以下の菌数では環境菌由来のシグナルが優位となり目的菌の検出ができなかった。この原因として、菌体の切り出しから核酸抽出、PCRに至る過程あるいは増幅酵素に環境菌そのものないし菌由来核酸がコンタミネーションしていることが考えられ、現在その解決の方策について検討を継続している。動物接種実験については並行して準備を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason LMD法により通常の細菌（大腸菌）について数十個程度の菌体からは目的とする細菌由来の遺伝子の検出が可能であったが、それ以下の菌数では環境菌が優位となり目的菌の検出が困難であり、その解決法の検討を行っている。
Strategy for Future Research Activity	LMD法に菌体の切り出しから核酸抽出、PCRに至る過程あるいは増幅酵素に環境菌そのものないし菌由来核酸がコンタミネーションしていることが考えられ、現在その解決の方策について検討を継続して行う。細菌数個を用いた診断が可能となった段階で動物への細菌接種を行い、in vivoでの診断が可能かを検討する。さらに臨床検体を用いた診断の可能性をさぐる。