2014 Fiscal Year Research-status Report
家族性パーキンソン病におけるmiRNAプロファイル解析と特異的miRNAの探索
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25461304
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| Research Institution | Department of Clinical Research, National Hospital Organization Tokushima National Hospital |
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Principal Investigator |
黒田 由紀子 独立行政法人国立病院機構徳島病院(臨床研究部), その他部局等, 研究員 (70398014)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三ツ井 貴夫 独立行政法人国立病院機構徳島病院(臨床研究部), その他部局等, その他 (80294726)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | パーキン / miRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
パーキンは家族性パーキンソン病の原因遺伝子（PARK 2）でミトコンドリアと関連した機能が報告されている。また別にパーキンは癌抑制遺伝子として作用することも注目されている。一方、私達は、パーキンのミトコンドリアに関連した機能についてパーキンをミトコンドリアへ運搬する未知の蛋白(Klokin1)を同定した。またパーキンは細胞増殖期にはミトコンドリア遺伝子の転写・複製を介したbiogenesisを促進することを見出した。本研究は、パーキンがmiRNAを介してミトコンドリアならびに核遺伝子の転写・複製に関与し得るか否かを明らかにすることを目的とし、そのmiRNAの探索を通して、家族性パーキンソン病の病態の解明を目指す。
私達はパーキンとDrosha複合体との関連を免疫沈降法で検討した。方法は、培養神経細胞SH-SY5Yを核・ミトコンドリア分画に分離し、おのおのを可溶化したのち、抗パーキン抗体(PRK8)を用いて免疫沈降を行った。その結果、ミトコンドリア分画においてもDrosha蛋白が検出された。さらに、パーキンに結合したDroshaが核分画およびミトコンドリア分画で検出された。この結果は、ミトコンドリアにおいてもpri-miRNAが存在し、Droshaの関与したmiRNAプロセッシングが起こっている可能性を示唆された。さらに我々はミトコンドリアおよび核分画においてパーキンに結合しているmicroRNAのクローニングを開始した。細胞をUV-クロスリンク処理したのち、可溶化したそれぞれの分画に抗パーキン抗体(PRK8)で免疫沈降を行い、沈降物よりmicroRNAを抽出し、クローニングを行った。その結果、ミトコンドリアおよび核分画において数種類のmicroRNAが同定できた。以上の結果から、パーキンがmicroRNAと関連した機能を有しておりパーキンが中心的役割を果たすと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
私達は、パーキンがミトコンドリア遺伝子の転写・複製を調整するという知見と、パーキンがp53に関連することやパーキンが癌抑制遺伝子としての機能する報告があることから、パーキンと関連したmiRNAを介して一元的に説明しうるために研究を進めている。私達はミトコンドリアにおいてパーキンはmicroRNAの成熟プロセッシングに関与しているとの仮説を立て研究を開始した。パーキンは細胞核においても局在が認められていること、p53に関連することから、核においてもmicroRNAとの関連が存在する可能性が考えられた。まず、私達はDrosha複合体パーキンとの関連を免疫沈降法で検討した。方法は、培養神経細胞SH-SY5Yを核・ミトコンドリア分画に分離し、おのおのを可溶化したのち、抗パーキン抗体(PRK8)を用いて免疫沈降を行った。その結果、ミトコンドリア分画においてもDrosha蛋白が検出された。さらに、パーキンに結合したDroshaが核分画およびミトコンドリア分画で検出された。この結果は、ミトコンドリアにおいてもpri-microRNAが存在し、Droshaの関与したmiicroRNAプロセッシングが起こっている可能性が示唆された。さらに、パーキンはDrosha複合体に結合し、核のみならずミトコンドリアにおいても、そのプロセッシングを担っている可能性を示すものであった。さらにミトコンドリアおよび核分画においてパーキンに結合しているmicroRNAのクローニングを開始した。細胞をUV-クロスリンク処理したのち、可溶化したそれぞれの分画に抗パーキン抗体(PRK8)で免疫沈降を行い、沈降物よりmicroRNAを抽出し、クローニングを行った。その結果、ミトコンドリアおよび核分画において数種類のmicroRNAが同定できた。その中で、最も恒常的にパーキンと結合していたのはmiR-132であった。私達はさらに、パーキンがこのmicroRNAの生成のプロセッシングに如何に関与しているのかを検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
a) 特異的miRNAのプロセッシング解析
特定されたmiRNAに関しては、in vitro pri-miRNA processing analysis & monitoringを行い、パーキン、PINK1、 DJ-1がmiRNA generationに直接関与しているか否かを明らかにする（方法はNature. 2009, 460, 529-533に準拠する）。
ｂ) 特異的miRNAを用いた細胞モデルの作成
それまでの研究でパーキン、PINK1、 DJ-1各々の欠損症の病態に関連すると考えられるmiRNAが同定された場合には、miRNAを合成し、野生型の培養細胞・MEF・fibloblastに導入し、その機能を解析することで、変異型のモデルになりうるか否かを検討する。また、逆にanti-sense RNAを変異型細胞に導入すると、アポトーシスならびに機能障害が回復するか否かを検討する。以上の研究成果が順調に得られた場合には、家族性パーキンソン病の治療法の開発にも繋がることが期待できる。
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| Causes of Carryover |
今年度は実験をはじめるにあたり、予想以上にアッセイ系セットアップに時間を有してしまい購入が遅れてしまったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度にアッセイ系セットアップは完了したためすぐに試薬等を購入し、アッセイ系をスタートできる予定である。
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Research Products
(5 results)
