2013 Fiscal Year Research-status Report
自己免疫性血友病13の分子病態；抗FXIII自己抗体の解析と発生機序の解明
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25461444
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
一瀬 白帝 山形大学, 医学部, 教授 (10241689)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 自己免疫性出血病 / 高齢化社会 / 慢性難治性疾患 / 分子病態 / 自己抗体 / エピトープ解析 / ユニバーサルエピトープ / 質量分析 |
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| Research Abstract |
１．AH13症例の抗FXIII抗体の性状解析：日本人後天性出血性血友病XIII/13症例から同定された抗XIII因子(FXIII)自己抗体（FXIIIインヒビター）は、免疫化学的性質と阻害特性から、三種類（Aa, Ab, B型）に分類された。
Aa型インヒビターはFXIIIの酵素部位であるAサブユニット（FXIII-A）に結合して、トロンビンによる活性化ペプチドの切断を阻害し、フィブリン分子間の架橋を著しく遅延させることを明らかにした。また、Aa型インヒビターはBサブユニットとの異種四量体形成を阻害し、さらに、FXIII異種四量体のFXIII-Bと入れ替わってFXIII-Aと複合体を形成することを見出した。
Ab型インヒビターは活性型FXIII-Aもしくは活性化中間体に結合して、トランスグルタミナーゼ活性を阻害することを明らかにした。
FXIII-Bに結合するB型自己抗体のうち、１例においてFXIII-A活性化ペプチドの切断およびフィブリン架橋反応の弱い阻害を認めた。
２．抗体のエピトープマッピング（マウスモノクローナル抗体の解析）：症例検体は貴重なので、まず作製済みのマウス抗ヒト第XIII因子Aサブユニット (F13A)モノクローナル抗体のエピトープ解析を行い、方法論の確立を行った。Protein G-Sepharoseと結合させたモノクローナル抗体とF13Aを結合後、Lys-C、トリプシンなどの切断酵素でF13Aを切断してProtein G-Sepharoseに結合した画分と結合しなかった画分を、それぞれ質量分析装置を用いて解析した（切断法）。また同時に、全体の75％をカバーする38種の合成ペプチドへの結合能を用いたELISA法でも認識部位の検討を行った（結合法と結合阻害法）。その結果、β-サンドウィッチおよびバレル1の領域を認識していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
１．抗体のエピトープマッピングについて；当初の計画では平成25年度は方法論の確立までで、実際の検体の解析は平成26年度からの予定であったが、一部解析を終えた。
予備的な実験で、後天性血友病13症例11例についてもほぼ同じ手法でエピトープ解析を行った。多くの症例のインヒビターが認識している領域（ユニバーサルエピトープ）の存在が示唆された。
２．抗FXIII抗体の性状解析について；異種四量体形成の阻害や活性化ペプチド切断の阻害といったこれまでに報告されていない新たな機序を見出している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度以降は当初の計画通りAH13症例の抗FXIII-A抗体の解析を進め、個々の症例での共通のエピトープとそれぞれ異なるエピトープを明らかにする。また合成ペプチドを用いたマッピングも計画通り実施する。さらにFXIII-B抗体に対するエピトープ解析法の確立、及び試用を行う。
１．AH13症例の自己抗体のエピトープマッピング：１）AH13症例の抗FXIII-A抗体の解析；平成25年度に開発した方法で、実際に症例の検体について分析する。２）抗体認識配列の同定；FXIII-Aと相同性のある組織トランスグルタミナーゼの各ドメインを入れ替えたキメラタンパク質や抗体が結合した領域からデザインした合成ペプチドを作製して、マッピングに用いる。３）AH13症例3例から得られた抗FXIII-B抗体の解析；８種類の作製済みのマウス抗ヒトFXIII-Bモノクローナル抗体と共に、上述した抗FXIII-A抗体と同様に解析する。
２．抗FXIII自己抗体を生成する根本的な原因（免疫寛容の破綻）の追究と抗原性の検討：F13A（及びF13B）遺伝子の多型性／変異を解析する。A. AH13症例のF13A（及びF13B）遺伝子の塩基配列を決定し、健常対照と比較して抗原性の違いの原因となる可能性がある遺伝的多型性や変異を同定する。B. AH13症例に共通の遺伝的多型性や変異を含むペプチドを合成して、それぞれの症例の自己抗体との反応性を検討する。
３．酵素触媒作用を持つ抗体や自然抗体の検索：AH13症例や健常者に、FXIII-Aを分解する酵素活性を持つ自己抗体や、自然抗FXIII抗体が存在する可能性を追究する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
ペプチドの作製が必要であったが、そのデザイン（アミノ酸配列）を海外の共同研究者と協議して決定するため時間がかかり、年度内に発注することができなかった。
ペプチドは5個で12万円必要であるが、24個まとめて発注すると約26万円で購入できるので、経済的効率を勘案して、平成26年度前半に前年度予算と新年度予算の消耗品費を合わせて発注する。
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[Journal Article] Severe inhibitor-negative acquired factor XIII/13 deficiency with aggressive subdural haemorrhage.2013
Author(s)
Kawano H, Yamamoto D, Uchihashi Y, Wakahashi K, Kawano Y, Sada A, Minagawa K, Katayama Y, Kohmura E, Souri M, Ichinose A.
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Journal Title
Blood Coagul Fibrinolysis.
Volume: 24
Pages: 638-641.
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Clot retraction is mediated by factor XIII-dependent fibrin-αIIbβ3-myosin axis in platelet sphingomyelin-rich membrane rafts.2013
Author(s)
Kasahara K, Kaneda M, Miki T, Iida K, Sekino-Suzuki N, Kawashima I, Suzuki H, Shimonaka M, Arai M, Ohno-Iwashita Y, Kojima S, Abe M, Kobayashi T, Okazaki T, Souri M, Ichinose A, Yamamoto N.
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Journal Title
Blood.
Volume: 122
Pages: 3340-3348.
DOI
Peer Reviewed
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