2014 Fiscal Year Research-status Report

サイトカインGIFのGerminal Centerにおける制御の分子機構の解明

Research Project

Project/Area Number	25461495
Research Institution	Tokyo Medical and Dental University
Principal Investigator	西條美佐東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 特任助教 (10566813)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	Germinal Center / CD4 T cell / Follicular helper T cell / アレルギー / GIF / Cysteinylation
Outline of Annual Research Achievements	Glycosylation-inhibiting factor(以下GIF)がCD4T細胞がサイトカインIL-4を分泌するTh2細胞へ分化を阻止し、B細胞からT細胞依存型のIgG, IgE抗体産生を阻止する機能をもつことを明らかにした。IL-4産生CD4T細胞にはTh2 CD4細胞の他にFollicular helper CD4細胞(以下TFH)が知られている。T細胞依存型抗体産生にはGCでのB 細胞と濾胞細胞特異的なTFH細胞との相互作用が必須であることが報告されている。　1.GIF knock out mouse におけるGCの検討; 1) 通常リンパ濾胞内に位置するGCが、GIF-/-マウスでは濾胞の外に位置することを再確認した。2) GCB細胞の数がGIFはGIF+/+マウスに比較して有意に増加していることを再確認した。3) ovalbuminで免疫したGIF+/+マウスとGIF-/-マウスから採取した脾臓CD4T細胞をin vitroでTFHに分化させ、両者のTFH細胞での発現分子の相違について検討した。GIFがCD4細胞のTh2分化だけではなくGCにおいてB細胞とTFHを制御し、抗体産生、アレルギー発症に重要である可能性が示唆された。2. GIFのcysteinylationの作用機序の解明 : recombinent GIFをcysteinylation 化し(以下modified GIF)、modified GIF特異的に結合するGIF 抗体を用いて、CD4T細胞、B細胞、好酸球に結合し、macrophage, NKT細胞とは結合しないことを再確認した。GIFはcysteinylation化によって生物活性を得、IL-4産生、IgE産生を制御することを見いだした。　3. GIFレセプターの同定: expression cloningの用法を用いて、modified GIF特異的に結合するmonoclonal 抗体に特異的に結合する細胞をFACS sortingし、候補遺伝子を見いだし、siRNAの手法を用いて候補遺伝子を絞り込んだ。レセプターの同定によってagonisticな抗体を作製し IgEの産生を阻止することによってアレルギーに対する創薬を検討できる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 昨年度の研究を継続して遂行、発展させることができた。 1.GIFによるGCでのT-B細胞相互作用の制御; GIF+/+, GIF-/- マウスをovalbumin を用いて免疫した脾臓から採取したCD4T細胞をin vitroでTFH分化の条件で培養し、IL-4の産生とTFH産生を制御するIL-21の産生を検討した。また、両マウスのTFH, Germinal Center B細胞をsortingし、microarrayを用いて相互の作用に必要な新規分子の同定の準備を行っている。2. cysteinylationの作用機序: modified GIFにspecificに結合する抗体を用いて、modified GIFが小胞体(Endoplasmic reticulum;ER)　Golgiに位置する事、unmodified GIFが細胞質にとどまることの再検討を行い、確認した。 3. GIFのレセプターの同定: expression cloningの手法を用いて同定したcandidateのsequenceをsiRNA,の手法を用いて、GIFのreceptorである検討を行い、さらにcandidateを絞り込むことができた。以上のように平成26年度に予定していた実験計画を予定通り行うことができた。
Strategy for Future Research Activity	今後の研究の推進方策 H26年度に行った研究を遂行し完成させる。さらに 1 GIFによるGCにおけるT-B細胞相互作用の制御; GIF+/+ マウス、GIF-/-マウスからTFH, GCB細胞を分離し、microarrayによって両者の発現分子の違いからTFH分化、GC分化と相互作用に必要な新規の分子を同定する。 2 Cysteinylation; immunoglobulin におけるcysteinylatinにおいてPD1もしくはErp57分子の関与が報告されている。これらの分子をknockdownして免疫染色しcysteinylationについて検討する。 3 GIFレセプターの同定1) GIF　レセプターが同定されればmodified GIFの結合を阻止するブロッキング抗体を作製し、この抗体を用いてGIF-/- マウスを用いて行った研究結果と一致することを確認する。2) agonisticな抗体の作製も検討する。この抗体はIL-4, IgEの産生を阻止することが予想される。この抗体を用いて、アレルギーなどに対する創薬を検討する。 4. 肥満におけるアレルギー発症の機序; 高脂肪食負荷を行ったGIF+/+, GIF-/-マウスに気管支喘息を発症させ、普通食下のマウスの喘息モデルと比較しGC B細胞、TFH細胞について検討し、代謝によるこれらの細胞への免疫的影響について検討する。