卵子特異的リンカーヒストンによるクロマチンリモデリングと遺伝子初期化誘導

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25462580
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 田中 守 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (20207145)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河村 和弘 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 准教授 (10344756)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 卵子 / H1foo / 初期化

Research Abstract

卵子特異的に発現が認められるヒストンタンパク質のH1fooの機能解析を進めるうえで、本年度は、生殖細胞への遺伝子導入を行う際の細胞株の育成を行った。当初の予定であった卵子へのH1foo遺伝子の導入は、導入効率や、遺伝子のタンパク質への翻訳のタイムラグ等の問題から、効率が低かったことから、より未熟な卵子に導入する必要が生じた。そこで、近年Tillyら(White et al., 2012)によってその存在が提唱されている卵子幹細胞を用いて、導入することを目的とした。卵子幹細胞は、特異的な表面抗原を用いて単離し、成長因子の添加によって高い増殖能を有することから、遺伝子導入には最適の細胞株である。しかし、既存の単離手法では再現性が低かったため、我々は表面抗原プロテオームスクリーニングを用いて卵巣に存在する細胞種の中から卵子幹細胞特異的な表面抗原マーカーを抽出し、高効率にそれらの細胞を回収することに成功した。さらに、回収した細胞を培養することで、増殖と共に不均一なコロニーを形成し、細胞種としても、不均一な遺伝子発現を示していたことから、培養液や培養環境を改良し、安定的に卵子幹細胞を増殖させる条件検討を行った。さらに、得られた卵子幹細胞培養を培養することで得られる卵子様細胞を溶解、RNAを抽出し、卵子特異的な遺伝子が発現していることを確認している。次年度は、作成した卵子幹細胞にCAGプロモータを接続したH1fooを導入し、強発現した卵子幹細胞から卵子へと分化誘導を行い、その後卵巣に移植してトランスジェニックマウスを得る予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成25年度実験計画に基づいて、遺伝子導入が簡便な細胞種の選定と、その後に得られるH1fooの機能解析に最適な生殖系列細胞を同定することに成功した。さらに、これらの細胞種に蛍光タンパク質を用いた遺伝子導入の試験と最適化を終了させていることから、おおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

（今年度の推進方策）
平成25年度は、最適な細胞種の選定を行い、これに成功してきた。平成26年度は、作成した細胞種にH1fooの遺伝子を導入し、さらに幹細胞であるiPSやES細胞への遺伝子導入も試み、生殖細胞としての機能と、多能性幹細胞との機能の違いを、マイクロアレイや、ペプチドアレイを用いて網羅的に解析し、その中から機能因子の絞り込みを行う予定である。さらに絞り込んだ候補因子は、遺伝子発現に関してはリアルタイムPCRを用いて、タンパク量の検出はWestern Blottingを用いて定量を行う。