2013 Fiscal Year Research-status Report
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25462756
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
林 康人 愛媛大学, 医学部附属病院, 講師 (70314953)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大橋 裕一 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00116005)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | keratocan / keratocyte / bio-imaging / gene targeting |
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| Research Abstract |
Keratocan-IRES2-nls-Cre とKeratocan-IRES2-CreERT2ノックインマウスの作製のため、遺伝子標的ベクター (gene targeting vector)を作製した。PCRによる相同組換え（homologous recombination)のスクリーニング条件の決定のために、３' fragmentを７kbに伸長したポジティブコントロールベクターを作製して、ES細胞にランダムインテグレーションで染色体遺伝子に組み込み、PCR（プライマーセットと反応条件）の条件を決定した。Keratocan遺伝子、IRES2-nls-Cre遺伝子、IRES2-CreERT2遺伝子に変異が存在しないことを、シクエンサーで確認後、理化学研究所CDBにおいてB6Nより作製されたES細胞（HK3i)に遺伝子標的ベクターをエレクトロポレーションで導入した。ES細胞にKeratocan-IRES2-nls-Creの ES細胞のコロニー192クローンとKeratocan-IRES2-CreERT2の ES細胞のコロニー192クローンをPCRで相同組換えのスクリーニングをしたが、陽性のクローンが得られず、遺伝子標的ベクターの５'fragmentを3.5kbから、6.7kbに伸長した遺伝子標的ベクターを再度作製した。ES細胞のクローンをKeratocan-IRES2-nls-Cre 384クローンとKeratocan-IRES2-CreERT2 192クローンのPCRスクリーニングを行い、Keratocan-IRES2-nls-Cre 9クローンKeratocan-IRES2-CreERT2 8クローンの陽性のクローンを得た。さらに、5'probe, 3'probe, NeoR probeを32P-CTPを用いて作製し、BamH1で切断したPCR陽性クローンの染色体DNAをサザンブロットで確認した。その結果、Keratocan-IRES2-nls-Cre 4クローンとKeratocan-IRES2-CreERT2 2クローンの相同組換えクローンに問題がないことを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在、理化学研究所CDBでキメラマウスをそれぞれ16匹と28匹作製し、現在、ジャームライン・トランスミッション（germline transmission）を確認中で，ほぼ予定どおりである。細胞膜CFP発現マウスを作製したが我々が使用している、レーザー顕微鏡（NikonA1R)のレーザー管の仕様の問題でシグナルを捉えるのが困難であることが判ったため、中止し、既存のマウスを購入することにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
Keratocan-IRES2-nls-Cre とKeratocan-IRES2-CreERT2のヘテロマウスを作製し、マウスの保存のため、雄を理化学研究所CDBに凍結保存用に預ける。Keratocan-IRES2-nls-Cre とKeratocan-IRES2-CreERT2をROSA26ｍTmGと交配して、CreERT2とCreが発現している細胞を発生、成長を通してバイオイメージングで確認する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
キメラマウスの購入、ジャームライン・トランスミッションの確認のための試薬の購入を持ち越したため。
ジャームライン・トランスミッションをPCRで確認。
現在所有しているレポーターマウスを使用し研究を行う。
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