2014 Fiscal Year Research-status Report
癌原性口腔細菌によるヒト上皮AID発現誘導とp53遺伝子変異の解析
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25462871
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
佐々木 実 岩手医科大学, 歯学部, 准教授 (40187133)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 口腔癌 / 感染発癌 / S. anginosus / AID |
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| Outline of Annual Research Achievements |
S. anginosusの口腔癌発症機序の解明を目的として，癌組織への本菌の感染，AID発現，さらに株化上皮細胞に加え正常歯肉上皮細胞へのS. anginosus菌体および菌由来生理活性物質SAAによるAID発現誘導，および細胞内シグナル伝達系について詳細に検討した．また，S. anginosusの重要なビルレンスファクターと考えられるSAAの遺伝子同定を行った．その結果，1. これまで明らかにして来た株化上皮細胞同様，正常ヒト歯肉上皮細胞でも対照に比べ菌体およびSAA刺激により，細胞内のAID遺伝子の発現誘導が認められた．2. 培養細胞を用いた細胞内シグナル伝達系の解析では，ヒト舌癌由来株化上皮細胞（DOK）および正常ヒト歯肉上皮細胞を用いて， S. anginosus菌体あるいはSAAで刺激した際の細胞内シグナル伝達系については前年度の系（NF-κBの活性化についてIκBαの分解をSDS-PAGE後にウエスタンブロッティング解析）ではうまく検出できなかったので，今年度はデュアルルシフェラーゼアッセイにより検討した．ウエスタンブロットに比べ高感度なためNF-κBの活性化を菌体およびSAA刺激でいずれの細胞でも認めることができた．3．S. anginosus菌由来抗原であるSAAの遺伝子のクローニング解析は，SAAを二次元電気泳動後，目的スポットのアミノ酸配列をLS/MSにより決定し，S. anginosus ゲノムDNAの情報をもとに同定した．
これらの成績から，口腔癌においてもAID遺伝子の異所性発現が亢進し，S. anginosusは口腔粘膜株化上皮細胞を含む正常歯肉上皮細胞でも，AID遺伝子発現を誘導すること明らかにした．また，S. anginosusによる上皮細胞からのAID発現誘導が細胞内シグナル伝達系のNF-kBを経由していることを解明した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
26年度は，前年度からの継続課題として，癌組織からのAID遺伝子発現およびS. anginosus感染の検出について検体数をさらに増やし検討した．その結果，対象口腔癌組織は10例増えて22例となり，それら組織をRNeasy kitを用いてRNAを抽出後，逆転写，リアルタイムPCRを実施しAID遺伝子の発現量を，また，DNAを精製しS. anginosus特異的プライマーで本菌の感染を検討した．例数が増したことにより， S. anginosus感染とAID発現に前年度より高い有意な関連性が認められた．また，前年度は株化培養上皮細胞におけるS. anginosus菌体および菌由来抗原（SAA）によるAID遺伝子の発現について検討したが，今年度は，初代培養口腔上皮細胞についても定量PCRで検討した．その結果，株化上皮細胞同様，歯肉上皮細胞でもAID遺伝子の発現誘導が認められ，正常歯肉上皮細胞でも株化細胞同様の応答性を示すことが明らかとなった．また，細胞内シグナル伝達系の解析をNF-kBについて，化学発光を利用したデュアルルシフェラーゼアッセイにより高感度での解析を行った．その結果，株化上皮細胞，正常歯肉上皮細胞ともS. anginosus菌体および菌由来抗原（SAA）により，NF-kBの活性化が認められた．また，NF-kB阻害剤添加により，AID遺伝子の発現誘導が有意に抑制されたことから，S. anginosus菌体および菌由来抗原（SAA）によるAID遺伝子の発現誘導にNF-kBの活性化が関与していることを明らかにした．さらに，S. anginosus菌由来抗原であるSAAの遺伝子のクローニング解析では，SAAを二次元電気泳動後，目的スポットのアミノ酸配列をLS/MSにより決定し，S. anginosus ゲノムDNAの情報をもとに同定した．従って，現在までの到達度としては，ほぼ当初の計画通りに進んでおり，おおむね順調に進展しているといえる．
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでのところおおむね順調に進展しているので，本研究課題の今後の推進方策として，27年度は，S. anginosus菌由来抗原であるSAAの遺伝子のクローニングデータをもとにSAAの組替えタンパク質の発現を行う．pGEXベクター等を用いた予備実験の少量発現系ではGST融合蛋白質およびHisタグタンパク質の両タンパク質を電気泳動で検出しているので，今後ラージスケールでリコンビナントSAA（rSAA）発現を行う．次にこのrSAAを用いて，これまで行って来たネイティブSAAによる培養細胞に対するAID発現ならびに細胞内シグナル伝達系（NF-kB）の活性化について検討する．さらに正常歯肉上皮細胞をrSAAで2ヶ月程度刺激後，あるいは正常歯肉上皮細胞にAIDを組み込んだ発現ベクターを導入し，それぞれ正常細胞でのp53遺伝子の変異が起こるかをDNAシークエンス解析から検討する．以上の実験から最終年度はS. anginosusによる上皮細胞へのAID発現に対する生理活性物質SAAの関連を明確にして，S. anginosusの口腔における感染発癌メカニズムを明らかにして行く予定である．
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| Causes of Carryover |
リアルタイムPCRで使用する反応液とチューブ，キャップ，さらに，サイトカインや酵素試薬等はいずれも高価であるが，キャンペーン実施中に購入することで定価から約20万円の節約となった．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
27年度研究費予算の使用計画としては，前年度からの繰越金を特にS. anginosus菌由来抗原であるSAAの組み替えタンパク質の発現を行うための組換えタンパク質の作製予算に充てる．すなわち，発現精製キット類，酵素試薬，生化学試薬，ベクター代に27年度予算とあわせて約300,000円，シークエンサー解析用消耗品，その他消耗品代として100,000円を使用する．さらに，培養細胞からのAID遺伝子発現ならびにp53遺伝子配列の解析では，酵素試薬，プライマー，リアルタイムPCR用試薬，プラスチック類，培地代として300,000円を使用する．その他ウエスタンブロッティング用試薬，ゲル消耗品代として100,000円使用する予定である．
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