超音波処理によるアミロイド線維形成を指標としたプリオンの新規迅速検出法

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25502004
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 村山 裕一 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究所・インフルエンザ・プリオン病研究センター, 上席研究員 (20192776)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 異常プリオン蛋白質 / 牛海綿状脳症 / アミロイド線維 / 超音波処理 / チオフラビンT

Outline of Annual Research Achievements

クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）や牛海綿状脳症（BSE）などのプリオン病の病原体は、高次構造が変化した異常プリオン蛋白質（PrPSc）であると考えられる。本研究では、超音波処理により、PrPScを核として急速にアミロイド線維が形成される反応を利用し、短時間でかつ高感度にPrPScを検出できる簡便で安全な検出方法を開発する。本年度は、リコンビナントプリオン蛋白質を用いて非定型BSEプリオンのアミロイド線維形成条件の検討を行った。
ウェル間のばらつきを検証するため、モデル蛋白質としてリゾチームを用い、酸性条件下、リゾチーム溶液(5 mg/ml)に変性剤（グアニジン塩酸、3 mol/L）およびチオフラビンT (ThT, 5 μM)を加え、全自動蛋白質異常凝集インデューサー装置（Hanabi）を用いて測定した。蛍光測定（Ex:445nm, Em:485nm）、超音波処理（15秒照射-0.1秒休止を5回）、培養（37℃、1時間）工程を40回繰り返した。反応が良好なウェルを選別した。さらに超音波照射を均一化する目的で、X軸方向にウェルを±8 mm振盪した。
ウシリコンビナントプリオン蛋白質（Hisタグ付、25 μg/ml）を1% Triton Xおよび4 mM EDTAを含むPBSで希釈し、ThT (5 μM)を加えたものを基質として用いた。またポリアニオンや蛋白質のリフォールディング作用を示すアルギニンを基質に加え、その効果を検討した。
その結果、リコンビナントプリオン蛋白質を基質に用いた場合、L型およびH型非定型BSEプリオンの検出が１～３時間で可能になった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

（１）リゾチームを用いた場合、8～13時間後に自発的なアミロイド線維の形成が認められた。アミロイド線維形成はA列およびH列のウェルで低く、また1行、12行目のウェルの形成が低い場合があり、外周部のウェルは適していないと考えられた。反応が良好なウェルを用いることにより、測定のばらつきを押さえることが可能になった。
（２）ウシリコンビナント蛋白質を基質に用いた場合、H型、L型BSE感染脳乳剤をシードとして添加してもThT蛍光の上昇はほとんど認められなかった。ポリアニオンを基質に添加しても効果は認められなかったが、アルギニン添加により、いずれの非定型BSEでもアミロイド線維形成が認められた。50mMのアルギニンを添加した場合、H型非定型BSE プリオンでは１～２時間で、L型非定型プリオンでは１～３時間で全ウェルのThT蛍光が上昇し、きわめて短時間で非定型BSEプリオンが検出できるようになった。。

Strategy for Future Research Activity

（１）反応基質に脳乳剤やリコンビナントプリオン蛋白質を用い、BSE感染牛の各組織、体液からの検出性を検討する。
（２）アミロイド産物のプロテアーゼ抵抗性や、脳乳剤を基質に用いたPMCAを用いて、シード能（感染能）を検証する。