2013 Fiscal Year Research-status Report
過食・ストレスとHDL代謝をつなぐニューロペプチドY受容体の解析
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25504009
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
加治 秀介 兵庫県立大学, 看護学部, 教授 (90224401)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ニューロペプチドY２受容体 / 遺伝子プロモーター / SNP / HDL代謝 / CETP / SR-B1 |
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| Research Abstract |
過食・ストレスによりニューロペプチドY（NPY)はY2受容体（Y2R)を介してメタボリックシンドロームの発症に関与することがマウスで報告されている。私共は健診者でY2R遺伝子プロモーターの2か所の1塩基多型（SNP1,2)においてSNP1ではGGがAAより、SNP2ではTTがCCより血中HDL-C値が低いことを報告した。
本研究ではY2Rの発現が最も高くなると予想されるGG/TTと最も低くなると予想されるAA/CCを含むY2R遺伝子上流をルシフェラーゼ発現ベクターに組み込み、培養ヒト肝細胞HepG2と、ヒト単球細胞THP-1をホルボールエステルで分化させたマクロファージ、さらに脂肪前駆細胞3T3-L1をインスリン等を含むカクテルで分化させた脂肪細胞に各々一過性発現させて転写活性を比較した。HepG2ではGG/TTがAA/CCに比し有意に転写活性が高かった(ベクターのみの対照との比率でGG/TT 4.90 vs AA/CC 1.48, P<0.05)。逆にマクロファージではGG/TTがAA/CCに比し有意に転写活性が低いことが明らかになった(GG/TT 1.50 vs. AA/CC 2.72, P<0.05)。脂肪細胞では差を認めなかった。
血中HDL-Cは肝臓で産生されるApoAI, ApoA1結合蛋白, CETP, LCAT, SR-B1, 肝リパーゼなどの影響を受ける。そこで培養HepG2において、これらのmRNA発現をリアルタイム PCRで定量し、NPY、Y2R拮抗薬（BIIE)の影響を調べた。非添加対照やNPY単独に比し、BIIEあるいはBIIE+NPYでCETP、SR-B1 mRNA発現が減少傾向を認め、肝臓においてはNPYはY2Rを介してCETPやSR-B1の遺伝子発現を促進し、動脈硬化リスクとなる血中HDL-C値の低下を招く可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の計画であるY2R遺伝子プロモーターの1塩基多型でY2Rの発現が最も高くなると予想されるGG/TTと最も低くなると予想されるAA/CCを含むY2R遺伝子をルシフェラーゼ発現ベクターに組み込むことができた。これを培養ヒト肝細胞HepG2と、ヒト単球細胞THP-1をホルボールエステルで分化させたマクロファージに各々一過性に発現させて転写活性を比較し、転写活性に有意の差を観察することができた。脂肪細胞3T3-L1をカクテルで分化させた脂肪細胞には転写活性の変化が認められなかったが、この細胞への十分な遺伝子導入が現法では困難であると考えられた。これらの差がSNP1ではSp1などの転写因子によるか、SNP2ではメチル化領域の変化によるかを確認することも今年度の計画ではあったが、まだ確認できていない。一方次年度に予定していた計画の一部であるHepG2での血中HDL-C値に影響を与える分子群のmRNA発現へのNPY、Y2R拮抗薬（BIIE)の影響をリアルタイムPCRで確認でき、全体的にはおおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）HepG2、マクロファージでY2R遺伝子転写活性にSNPの遺伝子型による差を認めているので、その分子機序を明らかにする。たとえばSNP1ではストレスで発現する転写因子Sp1との結合性をEMSAで、またSNP2ではメチル化との関係をバイサルファイト処理後の塩基配列決定などでSNPの遺伝子型間の違いを検討する。
２）マクロファージや血管内皮細胞でのHDL-Cに影響を与える分子群として、ABCA1, ABCG1, LIPGなどのmRNA発現がNPYやBIIEに影響されるかを検討する。HepG2やこれらの細胞で変化を認めた分子については、その変化が蛋白レベルでも認められるかELISA等で確認する。
３）購入可能なヒト脂肪細胞等を入手し、NPYとNPY+BIIEの2群でmRNAを抽出後、ConPathチップによる発現解析、GenMAPPによるpathway解析、ConPath Navigatorによる結果閲覧解析を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
転写活性の結果を得るのに時間がかかり、その差の分子機序を解明するための試薬類を残していたが、期間内に実施できなかったため、残額が生じた。
次年度に行う予定の上記実験に追加する計画である。
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[Journal Article] A prop1-binding factor, AES cloned by yeast two-hybrid assay represses PROP-1-induced Pit-1 gene expression2013
Author(s)
Sugiyama Y, Ikeshita N, Shibahara H, Yamamoto D, Kawagishi M, Iguchi G, Iida K, Takahashi Y, Kaji H, Chihara K, Okimura Y
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Journal Title
Molecular and Cellular Endocrinology
Volume: 376
Pages: 93-98
DOI
Peer Reviewed
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