2013 Fiscal Year Research-status Report
膜タンパク質の迅速な質量分析に向けた赤外線レーザーによる大気圧イオン化技術の開発
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25513004
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
間 久直 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (70437375)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | レーザーイオン化質量分析 / 赤外線レーザー / 大気圧イオン化 / 液体クロマトグラフィー / 膜タンパク質 |
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| Research Abstract |
①赤外線レーザーイオン源の開発
フリットと呼ばれる多孔質の金属製薄板を用い、液体クロマトグラフィー（liquid chromatography; LC）からの溶出液を連続的にイオン化させるために必要となる、LCとレーザーイオン化部とのインターフェイスを作製した。フリット表面から滲出するペプチド水溶液に波長6 μm帯の赤外線レーザーを照射することで試料溶媒の水がレーザー光を吸収し、ペプチド試料を連続的にイオン化させ、質量分析計で検出できることを示した。LCの溶媒として汎用されるアセトニトリルと水の混合溶液を用いた場合でも、波長6 μm帯の水の吸収、および7 μm帯のアセトニトリルの吸収を用いてペプチド試料をイオン化させることができることがわかった。さらに、赤外線レーザーイオン源を用いてLCと質量分析（mass spectrometry; MS）をオンラインで接続したLC/MSで、アセトニトリルと水の混合溶液を溶媒としたペプチド溶液の測定を行った結果、イオンクロマトグラムと質量スペクトルの両者を同時に得ることに成功した。
②膜タンパク質のイオン化条件の検討
可溶化剤を含んだ膜タンパク質溶液に赤外線レーザーを照射することで、大気圧下での膜タンパク質のイオン化を効率的に行うためには、レーザー波長、レーザー強度、試料溶媒や可溶化剤の影響など様々な項目の検討を行う必要がある。本年度は、イオン化用の赤外線レーザーに波長6 μm帯のレーザーを用いた場合と、波長3 μm帯のレーザーを用いた場合とでイオン化の効率を比較した。その結果、水溶媒中のペプチドのイオン化効率は波長6 μm帯、3 μm帯のどちらを用いてもほぼ同じであることを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①赤外線レーザーイオン源の開発
フリットを用いた赤外線レーザーイオン源の製作が完了し、水、またはアセトニトリルと水の混合溶液を溶媒としてペプチドをイオン化させ、質量分析計で検出することに成功した。さらに、赤外線レーザーイオン源を用いてLCとMSをオンラインで接続したLC/MSで、アセトニトリルと水の混合溶液を溶媒としたペプチド溶液の測定を行った結果、イオンクロマトグラムと質量スペクトルの両者を同時に得ることにも成功しており、計画どおりに進んでいると言える。
②膜タンパク質のイオン化条件の検討
可溶化剤を含んだ膜タンパク質溶液に赤外線レーザーを照射することで、大気圧下での膜タンパク質のイオン化を効率的に行うためには、レーザー波長、レーザー強度、試料溶媒や可溶化剤の影響など様々な項目の検討を行う必要がある。本年度は、イオン化用の赤外線レーザーに波長6 μm帯のレーザーを用いた場合と、波長3 μm帯のレーザーを用いた場合とでイオン化の効率を比較した。その結果として、水溶媒中のペプチドのイオン化効率は波長6 μm帯、3 μm帯のどちらを用いてもほぼ同じであることを示しており、計画どおりに進んでいると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
①質量分析装置へのイオン導入部の開発
赤外線レーザーの照射によって生成したイオンを質量分析装置内の高真空へ導入する部分の形状や温度、フリットとイオン導入部との位置関係などについて検討を行い、イオン導入部の設計・製作を行う。特に、LCの溶媒として緩衝液を用いる場合に問題となる塩の析出による目詰まりや汚染を防ぐような構造を検討する必要がある。大気中でイオン化を行い、差動排気によって質量分析装置内の高真空へイオンを導入する予定であるが、大気中には大量の中性粒子が存在しているため、生成したイオンの大部分が中性粒子との衝突などによって失われてしまう可能性がある。このため、フリット、およびイオン導入部の周辺を減圧して低真空にすることも検討している。中性粒子の減少によってイオンの損失を大幅に減らせることに加え、LCからの溶出液の気化が促進されることによるイオン化効率の向上も期待できる。LCとMSとをオンラインで接続し、実際に膜タンパク質の分析を行うことで、フリットの材質や構造、レーザー波長、レーザー強度、試料溶媒や可溶化剤の影響などについて検討する。
②オンラインLC/MSを用いた膜タンパク質の分析
LCとMSとをオンラインで接続し、膜タンパク質の分析を行う。LCの流量などを調整し、安定してイオンが得られる条件を明らかにする。精製された膜タンパク質試料の分析が安定して行えるようになってから、実際の分析に近い生体試料を用いた分析を行う。一般的なオンラインLC/MSのイオン化に汎用されているエレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization; ESI）を用いた場合との比較を通じて赤外線レーザーを用いたオンラインLC/MSの有用性を評価する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成25年度の赤外線レーザーイオン源の開発において予定よりも少ない試料で成果を得ることができたため。
平成26年度に行う膜タンパク質等の測定における試料購入費用として使用する予定である。
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