2013 Fiscal Year Research-status Report
植物ミトコンドリアゲノムの進化学的安定性と発生学的動態の解明
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25640102
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
森 直樹 神戸大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (60230075)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ミトコンドリアゲノム / プラズモン / 細胞質置換系統 / パンコムギ / Aegilops caudata / 進化的安定性 / 分子内組換え |
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| Research Abstract |
高等植物のミトコンドリアと葉緑体のゲノムは、核ゲノムとの複雑な相互作用を通じて細胞内の重要な機能に深く関わっている。この核ゲノムとオルガネラゲノムの相互作用の理解は、互いに異なる種の核と細胞質を組合せて作成された細胞質置換系統の研究によって大きく進展した。しかし、「異種核との同居」という強いストレス下に置かれたオルガネラゲノムの進化学的安定性はいまだ直接検証されていない。本研究では、ミトコンドリアゲノムに焦点を絞り、他に類を見ない60世代（半世紀以上）の長期にわたる連続戻し交雑によって育成・維持されてきた細胞質置換コムギを用いて、１）異種核ゲノムとの共存下でのミトコンドリアゲノムの遺伝的安定性を実験進化学的に検証し、２）多様な小分子種からなるミトコンドリアゲノムの発生学的動態の実相を明らかにする。これらの成果に基づき，互いに相反するかのような植物ミトコンドリアゲノムの２つの特性、すなわち、進化的安定性とダイナミックな発生学的動態が両立している機構の解明を試みる。
本年度は、木原によって世界で初めて育成されたAe. caudataの細胞質を持つ細胞質置換コムギ(C)-Tve と、その細胞質提供親(Ae. caudata)、さらにこの (C)-Tveから常脇によって再構成された(C-Tve)-Ae. caudata、さらにこの再構成の過程で得られた中間系統10系統の間でミトコンドリアゲノムを比較した。ミトコンドリアゲノムに散在する21のマクロサテライト座について調査したところ、WMt19座以外の19の座では変異は見られず、異種の核と組み合わされてきた細胞質ゲノムは進化的におおむね安定していることが示唆された。一方、WMt19座の近傍では何らかの構造変位が起きている可能性があるため次年度以降この領域についてもより詳細な解析を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では異種核ゲノムとの共存下におけるミトコンドリアゲノムの遺伝的安定性を実験的に検証する。平成25年度は、細胞質置換系統と、その核と細胞質の提供親系統ならびに復元されたAe. caudataとその再構成過程で得られた中間系統を用いて、それぞれの系統間でミトコンドリアゲノムの構造を互いに比較する計画であり、以下の１）から４）までの項目のうち、１）から３）まで順調に進展しているため計画はおおむね順調である。
１）上記の全系統を圃場にて育成し、それぞれから全DNAを抽出した。２）これらのDNAを用いて、ミトコンドリアゲノムに存在する21のマイクロサテライト座の変異を調査した。３）念のため、これに並行してコムギの葉緑体ゲノムに存在する24のマイクロサテライト座についても同様の解析を実施した。その結果、２４の葉緑体マクロサテライト座では上記の系統間で全く変異が見出されず、さらにミトコンドリアゲノムでは21のマクロサテライト座のうちのWMt19座を除きすべての座で変異がみられなかったことから、コムギのプラズモンは進化的安定性が高いことが判明した。
現在、26年度以降に予定している全塩基配列の解析に向けて、計画４）を遂行中で必要な植物材料の種子増殖を行っている。細胞質置換コムギ(C)-T. aestivum var. Tveは置換されたAe. caudataのC型細胞質の影響で高い雄性不稔を示し、種子を得るためには正常のTveを花粉親として交配する必要があるため、いかに効率よく交配種子を得ることができるかという点が今後の進展において重要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）25年度におけるマイクロサテライト座の解析から、細胞質置換系統で構造変異の可能性が示されたWMt19座の近傍を詳しく解析する。このために、細胞質置換系統とその細胞質ドナー、及び標準系統としてパンコムギ品種CSからラージスケール法によって多量のDNAを抽出し、ゲノミックサザン解析を行う。WMt19近傍に何らかの構造変異があれば、サザン解析の結果細胞質置換系統と細胞質提供親との間にRFLPが検出されることが期待される。
２）前年度に増殖した種子を用いて、細胞質置換系統およびその細胞質提供親と細胞質置換系統から再構成されたAe. caudataの3者のそれぞれからミトコンドリアDNAを単離・精製し、次世代シークエンサーによる全塩基配列の解析を行う。ここで課題となるのは、先の項目で述べたとおり、強い雄性不稔を示す細胞質置換系統(C)-Tveからいかにして大量の種子を得るかという点である。万一、大量の種子が得られない場合に備えて、少量の組織からミトコンドリアゲノムを精製する方法の開発も試みる。
3）サブゲノミック分子種（サブリモン）の発生学的動態を把握するため、すでに決定されているパンコムギ品種Chinese Springのミトコンドリアゲノムの配列をもとに、分子内組み換えに関与すると思われる2つの反復配列（R9及びR13）を選び、それぞれの反復の前後に特異的プライマーをデザインする。これらプライマーの組合せを互いに入れ換えてPCR解析をすることによって、特定の反復配列間で分子内組換えの有無を検証できる。まず、コムギの葉組織を使って分子内組換えによって生じたサブリモンの分子数を計測するための実験系を開発する。そのために、まず、判定量的PCR法によってDNA分子のコピー数の測定を行えるよう工夫する。次いで、リアルタイムPCR技術を応用してさらに精密な測定を試みる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本研究では、H26年度以降にミトコンドリアゲノムの塩基配列を解析を計画している。解析の際、核や葉緑体DNAの混入を極力抑えるためにミトコンドリアを単離精製してからDNAを抽出することが望ましい。ミトコンドリアの単離・精製には多量の種子を必要とするが、用いる細胞質置換コムギ(C)- Tveは置換されたAe. caudataのC型細胞質の影響で高い雄性不稔を示すため、大量の種子を得るのは容易でないと予想される。加えて、ゲノム内組換えによって生じるサブゲノミックな分子の動態を解析することも計画している。これら二つの理由から、26年度に少量の葉組織からミトコンドリアを単離する方法と、サブゲノミック分子の定量的解析法の新規開発を目指す。これらの開発過程で多く試行錯誤が予想され、消耗品費がH25年度よりも増加すると考えられたため、25年度の予算を節約して少しでも26年度に持ち越すことを考えた。
平成25年度から次年度に持ち越した研究費は、次の2点に投資する。１）少量の葉組織からのミトコンドリアDNAの精製技術の開発：まず少量のミトコンドリアを単離・精製し、その分画に混入してくる核DNAをDNase処理によって選択的に分解する方法を試みる。少量でも損傷の少ないミトコンドリア画分が得られれば、ミトコンドリアの膜外に混入してくる核DNAを選択的に分解することが可能だと考える。２）分子内組み換えによって生じるサブゲノミック分子の動態のモニタリング技術の開発：ミトコンドリアゲノムに2コピーだけ存在する反復配列を選び、これらに特異的なプライマーを用い、サイクル数を変化させて半定量的PCRを行う。この時に、用いるプライマーの組み合わせを入れ替えることで、組み換えの結果生じた分子だけを定量することも可能である。半定量的PCRが軌道に乗れば、さらに進めてリアルタイムPCRの装置を使った実験法も開発する。
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Research Products
(11 results)
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[Journal Article] Molecular genetic analysis of domestication traits in emmer wheat. I: Map construction and QTL analysis using a F2 population.2013
Author(s)
Thanh, P. T., Vladutu, C. I., Kianian, S. F., Thanh, P. T, Ishii, T., Nitta, M., Nasuda, S. and Mori, N.
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Journal Title
Biotechnology & Biotechnological Equipment
Volume: 27
Pages: 3627-3637
Peer Reviewed
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