2014 Fiscal Year Annual Research Report
幹細胞を用いた炎症部位特異的な新規遺伝子発現システムの開発とDDSへの応用
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25670259
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
橋田 充 京都大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (20135594)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山下 富義 京都大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (30243041)
樋口 ゆり子 京都大学, 健康長寿社会の総合医療開発ユニット, 特定講師 (40402797)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 遺伝子発現制御 / 幹細胞 / 炎症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、炎症部位において特異的に遺伝子発現が開始するシステムの構築である。炎症部位において、マクロファージや血管内皮細胞からTNFalpha などの炎症性サイトカインが産生され、それが刺激となりユビキチン-プロテアソーム経路によるIkappaBの分解が促進され、NFkappaBの核への移行および転写活性化されることが知られている。これを利用して、初年度は、IkappaBと蛍光タンパク質mKO2の融合体を作成し、その融合タンパク質を発現した細胞にTNFalphaを添加すると蛍光シグナルが減少することを確認した。本年度は、まず、IkappaB-mKO2を発現させたHela細胞の抽出物に対してウエスタンブロット法によって融合タンパク質の分解ならびに内在性のIkappaBの分解を確認した。次に、遺伝子発現制御を目的にIkppaBとtetリプレッサーの融合タンパク質を発現するベクターを構築した。このベクターをトランスフェクションしたHela細胞の抽出物において、tetリプレッサーとIkappaBの融合体が発現していることをウエスタンブロット法により確認した。リプレッサーの融合体を発現するベクターと、オペレーターの下流にLacZの配列を挿入したベクターを6:1以上の混合比で一緒にトランスフェクションさせると、リプレッサーがLacZの発現を十分抑制することを確認した。さらに、リプレッサーの融合タンパク質とオペレーターを発現する細胞にTNFalphaを添加するとLacZの発現が認められ、この発現は、予めprotease inhibiterを作用させておくと抑制されることを確認した。以上の結果より、proteasomeによる分解によりLacZの発現が誘導されたことが示唆された。
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