ヒトにおける温度感知機構の構造生物学

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25711004
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 日野 智也 鳥取大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (40373360)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: TRPチャネル / イオンチャネル / 膜タンパク質 / 立体構造解析

Outline of Annual Research Achievements

温度は、生物の生命活動の恒常性を維持するうえで極めて重要な物理パラメーターである。ヒトでは、30℃を中心として前後15℃程度の範囲を冷感や温感として識別することができ、さらにはこの範囲を超える温度域においては温度感覚とともに痛みの発生を伴う。この温度感覚発生の中心的役割を担うのが非選択的陽イオンチャネルとして機能するTRPチャネルファミリーである。本研究では、ヒトにおける温度感覚の分子メカニズムの解明を目指し、特に低温感知を担うTRPA1および高温感知を担うTRPV1の高分解能結晶構造解析を目的とする。TRPA1については、出芽酵母発現系およびピキア酵母発現系を用いて大量発現を試みたが、構造解析に十分な発現が得られなかった。そこで、ピキア酵母のコドン使用頻度に最適化したヒト由来TRPA1遺伝子を合成し、ピキア酵母へ導入した。その結果、ヒト由来塩基配列と比較して、4倍以上の発現量を得ることができた。TRPV1については、昨年度までにピキア酵母を用いた大量発現系を構築し、高い発現量が得られる菌株を得たが、精製時に凝集する傾向が強かったため、構造解析に十分な量の精製試料を得ることが困難であった。そこで、精製途中での凝集を抑制するために、蛍光ゲルろ過法を用いた熱安定性測定によりTRPV1の安定性を高める条件を探索した。その結果、コレステロール誘導体であるコレステリルヘミサクシネートの添加や高塩濃度条件において、凝集形成を抑制できることが明らかになった。また、Hisタグを用いた精製では夾雑タンパク質の混入や凝集形成が顕著であったため、GFPと特異的に高い親和性で結合するnanobodyを用いたaffinity精製法を用いることで、これらのTRPチャネルを短時間・高純度で精製できるようになった。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Causes of Carryover

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Expenditure Plan for Carryover Budget

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Crystal structure of d‐stereospecific amidohydrolase from Streptomyces sp. 82F2–insight into the structural factors for substrate specificity (2016)
  • Author(s): Arima J., Shimone K., Miyatani K., Tsunehara Y., Isoda Y., Hino T., Nagano S.
  • Journal Title: FEBS Journal Volume: 283 Pages: 337-349
  • DOI: 10.1111/febs.13579
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of the anion exchanger domain of human erythrocyte band 3 (2015)
  • Author(s): Arakawa T., Kobayashi-Yurugi T., Alguel Y., Iwanari H., Hatae H., Iwata M., Abe Y., Hino T., Ikeda-Suno C., KumaH. , Kang D., Murata T., Hamakubo T., Cameron A. D., Kobayashi T., Hamasaki N., Iwata S.
  • Journal Title: Science Volume: 350 Pages: 680-684
  • DOI: 10.1126/science.aaa4335
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The crystal structure of heme acquisition system A from Yersinia pseudotuberculosis (HasA ypt): Roles of the axial ligand Tyr75 and two distal arginines in heme binding (2015)
  • Author(s): Kanadani M., Sato T., Hino T., Nagano S., Ozaki S.
  • Journal Title: Journal of inorganic biochemistry Volume: 151 Pages: 26-33
  • DOI: 10.1016/j.jinorgbio.2015.07.007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure and mechanism of the mammalian fructose transporter GLUT5 (2015)
  • Author(s): Nomura N., Verdon G., Kang H. J., Shimamura T., Nomura Y., Sonoda Y., Hussien S. A., Qureshi A. A., Coincon M., Sato Y., Abe H., Nakada-Nakura Y., Hino T., Arakawa T., Kusano-Arai O., Iwanari H., Murata T., Kobayashi T., Hamakubo T., Kasahara M., Iwata S., Drew D.
  • Journal Title: Nature Volume: 526 Pages: 397-401
  • DOI: 10.1038/nature14909
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Crystal structures of the human adiponectin receptors (2015)
  • Author(s): Tanabe H., Fujii Y., Okada-Iwabu M., Iwabu M., Nakamura Y., Hosaka T., Motoyama K., Ikeda M., Wakiyama M., Terada T., Ohsawa N., Hato M., Ogasawara S., Hino T., Murata T., Iwata S., Hirata K., Kawano Y., Yamamoto M., Kimura-Someya T., Shirouzu M., Yamauchi T., Kadowaki T., Yokoyama S.
  • Journal Title: Nature Volume: 520 Pages: 312-316
  • DOI: 10.1038/nature14301
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ヒト由来TRPM8の立体構造解析に向けた高純度精製試料調製の検討 (2015)
  • Author(s): 川越 雄斗，落合 晶也，三牧 裕哉，日野 智也，永野 真吾
  • Organizer: 第88回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-02