2014 Fiscal Year Annual Research Report
魚類の生殖細胞における異質なゲノム構成が配偶子形成に与える影響の解明
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25712021
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
藤本 貴史 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 准教授 (10400003)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 減数分裂 / クローン / ゲノム構成 / 生殖細胞 / 染色体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
重要な解析家系である四倍体クローン子孫の誘起に成功し、その一部についてはアンドロゲン処理によるオス化を行い、現在、解析に向けて飼育を継続している。また、異質ゲノムをもつ組合せとして、ドジョウとカラドジョウとの交配に由来する二倍体雑種と三倍体雑種の両家系を樹立し、妊性と配偶子形成の解析に向けて継続して飼育中である。ドジョウの系統間三倍体雑種では雌雄で成熟個体が得られ、それらの交配試験の結果、雄では運動性を示す精子は得られず不妊性を示し、精巣の倍数性測定においても減数分裂を完了した細胞に相当するDNA量を示す細胞集団は検出されなかった。一方、雌では排卵誘起によって卵が得られ、これらの卵は半数性と二倍性であることが明らかとなり、減数分裂時にゲノム削減が起こることを示唆する結果が得られた。
ドジョウA系統、B系統、クローン系統の卵巣・精巣を対象に次世代シークエンサーを用いたトランスクリプトーム解析では、ドジョウ生殖腺ESTデータベースを構築し、相同性検索から既知の生殖細胞特異的に発現する遺伝子や、減数分裂関連遺伝子の部分配列が得られた。また、各系統の卵巣のトランスクリプトーム解析を行った結果、クローン系統に特異的に発現変動を示すコンティグが得られ、それの一部には細胞分裂に関連する遺伝子が含まれることが明らかとなった。この解析からこれらの候補遺伝子を用いることにより、詳細な発現動態解析が可能な段階に至った。
FISHとGISHを用いた染色体レベルでの各系統間のゲノムやクローンを構成するゲノムの異質性の調査では、系統間で異なる反復配列のFISH解析とGISH解析により、クローンがA系統とB系統に由来する染色体で構成されていることが示唆された。さらに、FISH解析ではクローンの減数分裂時には減数分裂前核内分裂で倍加した同祖染色体同士で対合することが細胞遺伝学的に明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度に予定していた実験群を誘起することができ、解析にむけた個体を準備することができた。現在はそれらを継続して成熟に向けて飼育するとともに、継時的に固定して組織学的解析に供しているところである。また、既に作出した個体の一部は成熟に達し、妊性のチェックや産出される配偶子の倍数性、ゲノム構成について調査を行った。その結果、それらの生殖腺ではゲノム削減のイベントが生じており、組織解析等に供することが可能な個体を得ることができた。更に、現時点では研究計画において解析予定のほぼすべてのゲノム構成の個体の整備が終了した。これらを解析に用いることにより、最終年度にゲノム構成と配偶子形成に関する体系的なデータを収集することが可能となった。
A系統、B系統、クローン系統の生殖腺に由来する全RNAを用いた次世代シークエンサー解析によって卵巣や精巣、両者を統合した生殖腺ＥＳＴデータベースを構築することができた。これらを用いることによって、ドジョウの生殖腺において発現している減数分裂段階を規定する様々な遺伝子の全長単離が容易に行うことが可能になった。また、各系統のデータセットを用いたトランスクリプトーム解析により、クローン系統で特異的な発現変動を示すコンティグ配列を得るに至った。これらの候補遺伝子を精査し、定量ＰＣＲ等による発現解析を行うことによりゲノム倍加や削減のイベントに強く関与する遺伝子を特定できる可能性を示唆している。
細胞遺伝学的解析では染色体のＢ系統の判別が可能な反復配列を得ることができた。この反復配列によってクローンゲノムの減数分裂時における各系統の詳細な染色体挙動を追跡調査し、これまで不明であった各系統の染色体の対合状況を解明するに至った。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで作出してきた解析家系の個体を成熟に向けて飼育し、それらの妊性と配偶子特性を解明するとともに、配偶子形成様式が明らかとなった個体の生殖腺を組織学的に解析することによってゲノム倍加と削減のイベントを明らかにする。また、サンプリング時に一部のサンプルを遺伝子発現解析用に保存し、次項のトランスクリプトーム解析で候補となったゲノム倍加・削減関連遺伝子の定量解析に供する。また、各家系の未成熟個体に関しても同様の組織解析を行うとともに、細胞学的解析と遺伝子発現解析に供し、倍加・削減イベントの解明に向けた基礎データの蓄積を行う。
次世代シークエンサーを用いたトランスクリプトーム解析では、今年度に成熟することが期待される四倍体クローン個体とクローン由来三倍体をRNA-seq解析に供し発現遺伝子のデータ収集を行う。その後、リードカウントをベースとした遺伝子発現解析に加え、四倍体クローンvs.二倍体クローンやクローン由来三倍体vs.両性生殖二倍体間で特徴的な発現動態を示すコンティグを特定し、ゲノム倍加・削減イベントに強く関連する遺伝子群の探索を行う。
これまでの研究で明らかとなったＢ系統の判別が可能な反復配列をプローブと同様に、Ａ系統に特異的なシグナルを与える新規のプローブを開発することにより、両系統を確実に識別可能な解析系の樹立を試みる。更に、染色体標本以外の組織切片や単離細胞においてもFISHによるゲノム識別の可能性を検討する。本試験では通常の蛍光顕微鏡を用いる方法以外に、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いたより解像度の高い解析法を試みる。
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| Causes of Carryover |
平成26年度収支決算報告書の基金助成金における次年度使用額757,620円には、平成27年3月に納品分の463,842円分が含まれており、平成27年度での実質的な執行可能金額は293,778円となる。
平成26年度にはNGSデータの解析に向けてワークステーションと解析ソフトを平成26年度の補助金を用いて購入し、初年度に得られたNGSデータの解析を行うことができた。そして、初年度に作出できなかったクローン四倍体家系についても平成26年度には個体を誘起できたことから、平成27年度にはこれらを用いた次世代シークエンス解析を行う必要が生じた。本解析では1サンプル当たり、150,000円～250,000円の費用がかかる。そのため、平成26年度に誘起したクローン四倍体個体が成熟し、解析可能となる平成27年度で次世代シークエンス解析を行うために、学術研究助成基金助成金の一部を次年度使用額とした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
解析対象個体が成熟し、サンプルとして使用可能となった時点で次世代シークエンス解析を受託業者に外注し、トランスクリプトーム解析に向けたリードデータを得る。
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