Identification of novel double fertilization regulators locating on the female gamete surface

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25840113
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 井川 智子 千葉大学, 大学院園芸学研究科, 助教 (00360488)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 卵細胞 / プロテオーム / 膜タンパク質 / 被子植物

Outline of Annual Research Achievements

被子植物の重複受精は配偶子細胞膜上に存在する分子によって制御されるが、現在までに同定された配偶子膜局在型の受精因子は精細胞特異的なタンパク質のみであり、雌性側の受精因子はまだ発見されていない。本研究では、シロイヌナズナの卵細胞膜タンパク質を精製してプロテオーム解析を行い、新規の雌性側受精因子の探索を目指した。
以前に申請者が作製した、卵細胞膜を特異的にGFPで標識したマーカーラインpDD45::AtPIP-GFPを用いた（Igawa et al. 2013）。成熟し、かつ未受精の卵細胞を得るため、開花前日に除雄し、翌日雌ずい組織を回収した。回収した雌ずい組織（約0.1g相当）を界面活性剤を含むバッファー中で潰し、遠心後に得られた可溶性画分を、GFP抗体による免疫沈降に用いた。比較として野生型の雌ずいから同様にタンパク質抽出と免疫沈降を行った。これらの精製タンパク質についてプロテオーム解析を行った。その結果、pDD45::AtPIP-GFPに特異的なタンパク質が複数同定され、その中にはAtPIPとGFPが含まれていた。この結果から、本研究で行った方法によって卵細胞で特異的に発現させた膜タンパク質が雌ずい組織から回収可能であることを示した。本方法は、被子植物卵細胞のタンパク質精製において、胚珠組織から卵細胞を回収するプロセスを省略できるという点で大きな利点を持ち、本方法開発についての論文を学術誌に投稿中である。さらに、同定タンパク質のうち推定膜貫通領域を持つ候補因子について遺伝子破壊株を入手して稔性を調査した。しかしながら、一因子のみで受精に直接関与すると思われるものはなかった。しかし、本研究で確立された精製方法は既知の雄性受精因子との相互作用タンパク質を同定する目的にも適用でき、今後の研究展開に繋がる成果となった。