2013 Fiscal Year Research-status Report
上皮集団遊走において先端細胞に高い運動性を与える分子機構
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25860215
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
栗栖 修作 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 特命助教 (40525531)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 集団遊走 / 細胞遊走 / IRSp53 / Eps8 / 上皮 |
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| Research Abstract |
本研究では上皮集団遊走において、頂端膜の構造的破綻がリーダー細胞の浸潤能亢進の引き金になる、との仮説を検証することを目的としている。平成２５年度の目標は（A）リーダー細胞とフォロー細胞の違いを免疫染色等により明らかにすること、（B）頂端膜を人為的に乱した場合の集団遊走に与える影響、（C）頂端膜にトラップされる遊走関連分子の網羅的探索、であった。
まず、（A）に関していくつかの発見があった。私が見出していた新規頂端膜マーカーIRSp53は、未刺激時の細胞やHGF刺激後のフォロー細胞では頂端膜に濃縮するのに対し、HGF刺激時の頂端膜を喪失したリーダー細胞では基底膜側に形成される浸潤突起に強く移行していた。同様の局在変化はEzrinでも観察された。一方、微絨毛性ミオシン（Myosin-ID）はフォロー細胞では頂端膜に濃縮するものの、リーダー細胞では浸潤突起に濃縮を認めなかった。この結果から、IRSp53とEzrinがリーダー細胞特異的な浸潤性に関与することが示唆された。
（B）に関しては未だ着手できていない。前述のIRSp53とEzrinの特徴的な局在変化の原因を追求することが重要と考え、（C）を優先したためである。
（C）に関して、MDCK細胞におけるIRSp53の免疫沈降物をLC-MS/MSで分析した。その結果、同定されたペプチド数が最も多かったのはEps8というタンパク質であった。Eps8はF-actin結合タンパク質であり、微絨毛に濃縮することが知られている。まだ予備段階ではあるが、Eps8とIRSp53の結合は上皮系細胞で強く、間葉系細胞でかなり弱くなることが分かってきた。このことから、フォロー細胞ではIRSp53はEps8によってトラップされ不活性な状態にあり、リーダー細胞では両者が離れてIRSp53が活性化し浸潤能を亢進している、と考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上述の（A）に関しては概ね予定通りに進行した。（C）に関してはIRSp53結合タンパク質を同定し、その中でEps8に関しては結合領域の決定やIRSp53と結合できない変異体の作製等まで進行し、当初の計画を上回るペースで遂行できた。一方、（B）に関しては未だ着手できておらず、次年度はまず頂端膜を壊す操作によって上皮細胞の浸潤性が亢進するのかどうか、早急に確かめなければならない。
当初の実験計画ではMDCK細胞を用いるとしていたが、研究仮説の妥当性をより広く検証するため、ブタ腎上皮細胞株LLC-Pk1も並行して実験に用いた。このため、実験量が増えたことにより研究の進行がやや遅れた面もあるが、それ以上に研究の一般性を強めることが出来たことは意義深いと考えている。
本研究の独創的な点として掲げた「頂端膜の存在自体が細胞遊走を抑制する」との仮説に対し、部分的ではあるが答えが得られてきたと考えている。その理由として、Eps8は頂端膜に存在する微絨毛の構成因子であり、Eps8がIRSp53をトラップ・リリースすることによって細胞の浸潤性がコントロールされていることを支持するデータが得られてきたからである。したがって、今後はEps8とIRSp53の結合を中心に研究を進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の鍵となるのは（i）頂端膜を壊す操作によってEps8とIRSp53の結合が弱くなるのか、（ii）リーダー細胞でEps8の抑制から解き放たれたIRSp53が浸潤性に関与するのか、この２点であると考えている。これらは前述の（B）をより具体化した実験目標であり、次年度はこれを検証する実験からスタートする予定である。頂端膜を破壊する操作として、NHERF1やMyosin-IAのノックダウンを行う予定であるが、これらはがん抑制遺伝子であることが示唆されており医学的見地からきわめて重要である。
次年度のもう一つの目標は、IRSp53とEps8の結合がどのように制御されているのか分子レベルで解明することである。今の段階では推論の域を出ないが、IRSp53とEps8はフォロー細胞で結合し、リーダー細胞で解離していると考えている。例えばリーダー細胞（あるいはフォロー細胞）ではEps8やIRSp53が何らかの翻訳後修飾を受け、両者の結合のON/OFFがなされているとも考えられる。既にIRSp53と結合できないEps8変異体がいくつか得られており、これらを用いて、両者の結合の生化学的特性、および結合の有無による細胞遊走能の変化を調べる予定である。
次年度は最終年度であるため、研究成果を論文として国際誌に発表することを目指す。そのため次年度の前半は上述の実験方針に加え、論文作製にも力を注ぐ予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
学会参加は当初一回の予定であったが、本年度は二回参加したため予定額の６万円を超え、約１４万円となった。
一方、物品費に関しては当初の１９４万円を下回り、約１００万円となった。その理由として、本年度は頂端膜の人為的破壊操作として使用する予定であったsiRNAの購入がなかったためである。頂端膜を乱すためのsiRNAを用いた実験は次年度行うこととして、本年度はIRSp53とEps8の結合の生化学的解析に力を注いだ。結合解析に必要な試薬・器具等は安価であったため、本年度は使用予定額を下回る結果となった。
次年度は上記の通り、頂端膜を破壊するためのsiRNAや薬品等の購入費として約８０万円を予定している。また、細胞の形態や浸潤性を調べるための細胞生物学的解析や、その他生化学実験などに用いる薬品・器具等のための費用として、約１００万円を見込んでいる。
次年度は最終年度であるため、国際学会への参加や学術論文の準備・発表に必要な予算として約５０万円を見込んでいる。
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