2014 Fiscal Year Research-status Report
癌細胞を標的とする選択的増殖型遺伝子組換えレオウイルスを用いた新規癌治療法の開発
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25860340
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
金井 祐太 大阪大学, 微生物病研究所, 特任講師 (80506501)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | レオウイルス / 癌 / イメージング / 治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類オルソレオウイルス（以下MRV）は様々な癌に対して優れた殺腫瘍活性を示すことから、腫瘍溶解性ウイルスとして、癌治療への医薬品応用が有望視されている。本研究は、MRVで応用が困難であったウイルス遺伝子改変技術を導入・駆使することで、より安全で治療効果の高い腫瘍溶解性ウイルスベクターの開発研究の基盤を目的とする。
我々はまず複数のMRV株の抗腫瘍活性を比較し、より腫瘍溶解能の強い株の選定を行った。腫瘍溶解性MRVとしてこれまで3型のT3D-C株が用いられてきた。我々はT3D-C株の他に、T1L株、T3D-F株を用いて、培養癌細胞に対する腫瘍溶解性を比較したところ、T3D-C株が顕著に強い腫瘍溶解性を示した。T3D-C株はReolysinという名称で抗腫瘍剤としての開発が進められており、我々はT3D-C株をベースにしたRG系の確立を試みた。T3D-C株の各遺伝子分節をプラスミドにクローニングし、L929細胞内でウイルス遺伝子の発現を行ったところ、感染性のあるT3D-C株を得ることが出来た。この人工遺伝子由来のT3D-C株はin vitro, in vivoにおいて野生型と同程度の抗腫瘍活性を示した。
次に外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子をMRVの遺伝子に挿入したところルシフェラーゼを発現するレポーターMRVが得られた。レポーターMRVは培養細胞への感染において強いルシフェラーゼ活性を示した。さらにマウスへの感染を行ったところ、感染部位に強いルシフェラーゼ活性が認められ、MRV感染の生体イメージングに成功した。
次にT3D-C株を用いて癌細胞に対する感染性の向上を試みた。MRV外層タンパクであるSigmaCにインテグリン結合能を有するRGD配列を挿入した組換えMRVを作製したところ、一部の癌細胞において顕著な感染性の向上が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究では、初年度の研究計画として１）抗腫瘍効果の高いレオウイルス（MRV）株の選定、２）RG系の樹立、3）組換えウイルスの作成を予定していた。
（１）については3種のMRV株（T1L, T3D-F, T3D-C）を比較することで抗腫瘍活性の高いT3D-C株を同定した。計画当初はランダム変異導入や2株の同時感染による組換えウイルス作出を予定していたが、すでに抗がん剤として臨床試験が行われていたT3D-C株の顕著な腫瘍溶解能を確認できたため、それ以上の試みは現時点において必要ないと判断した。（２）については、T3D-C株よりクローニングした遺伝子分節を細胞に導入することで野生型と同じウイルスが得られ、RG系の樹立をすることができた。（３）については外来遺伝子としてルシフェラーゼを組み込んだ組換えウイルスが得られ、感染細胞においては基質の添加により発光が認められた。さらにこのレポーターMRVをマウスに感染させたところ、野生型と同様の感染経過を示し、さらに感染部位に強いルシフェラーゼ活性が認められ、MRV感染における生体イメージングに成功した。
さらに別の組換えウイルスとしてウイルス外層タンパクsigma 1にRGDモチーフを付加した組換えウイルスを作成した。RGDモチーフは特定のインテグリンに対し強い親和性を示すことが知られている。このRGD-MRVを用いて癌細胞に対する抗腫瘍活性を検討したところ、一部の癌細胞において抗腫瘍活性が顕著に上昇していることが確認された。この癌細胞ではMRV本来の感染受容体の発現が低下していることが判明し、RGDのインテグリンに対する親和性が感染性の向上につながったことが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに腫瘍溶解性の高いレオウイルス（MRV） T3Dcd株のRG系を樹立し、さらに外来遺伝子としてルシフェラーゼを発現するレポーターMRVおよび癌細胞に対する感染性が向上したRGD-MRVが得られた。最終年度は得られた2種の組換えウイルスを用いてマウス感染モデルを用いた腫瘍の検出および抗腫瘍効果の検討を行う。まず、レポーターMRVを用いた癌細胞の検出では癌細胞を移植したヌードマウスに対しレポーターMRV の感染を行う。我々のこれまでの結果では、MRV本来の感染部位である肺、腸管に強いルシフェラーゼ活性が認められたが、先に腫瘍を移植することで癌細胞へも感染が起こり、腫瘍組織の生体イメージングが期待される。
また我々の作成したRGD-MRVは特定の癌細胞に対し、顕著な感染性の向上が認められた。最終年度には効果の認められた癌細胞をヌードマウスに移植し、in vivoにおけるRGD-MRVの抗腫瘍活性の検討を行う。
またルシフェラーゼ遺伝子以外の外来遺伝子として、他の抗腫瘍ウイルスで効果が得られているGM-CSFなどのサイトカイン（IL18、IFNβ等）を外来遺伝子として発現する組換えウイルスの作成も同時に試みる予定である。
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| Causes of Carryover |
平成26年度は、すでに得られていたレポーターMRVのマウスでの生体イメージングの検討を行ったが、当初は期待していたシグナルが得られず、時間がかかった。そのため予定していたサイトカイン等の外来遺伝子発現組換えMRVの作成を行わなかった。またマウス感染実験では1回の実験ごとに解析に時間がかかったため、予定より予算の消化が少なくなった。
RGDモチーフを付加したMRVの作成では、RGDをウイルス外層のsigma 1タンパクに挿入したが、sigma 1タンパクがウイルスの感染受容体と結合する重要なウイルスタンパクであることから、高い感染性を保持した組換えウイルスの作成は難航が予想されたが、実際には少ない試行により感染性の向上したウイルスを得ることが出来たため、当初の予定より少ない予算で完遂することができた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度は、主にこれまでに得られた組換えウイルスのin vivoにおける抗腫瘍効果について検討を行う。そのため次年度は動物実験関係を主な予算の使用目的とする。またRGD付加により感染性が向上したRGD-MRVについては、ウイルス受容体とインテグリンについての検討を行うため、生化学実験関係の予算を計上している。動物実験により得られた結果の解析を行うため、分子生物学、生化学関係の予算を計上する。また得られた成果についての学会発表も予定しているため、旅費を計上する。
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Research Products
(1 results)
