低酸素誘導性因子HIFの活性化による肺胞上皮細胞保護効果の検討

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25861392
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 高木 俊介 横浜市立大学, 附属病院, 助教 (90644823)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 肺傷害 / アポトーシス / 低酸素誘導性因子

Research Abstract

肺胞上皮細胞株MLE15を用いて，HIF-1 alphaの分解を抑制するDMOGの投与がFasL/Fas系によるアポトーシスにどのような影響をあたえるのかを検討した．DMOGが1mMの濃度で十分にHIF-1 alphaを増加させることをELISA法で確認するとともに，下流遺伝子の増加が見られることを定量的PCR法で確認した．
FasLを細胞に投与した際のアポトーシスの抑制についてcaspase 3/7の活性，さらにTUNNELフローサイトメトリーによって検討した．DMOGはこれらの指標を全て，低下させ抗アポトーシス作用があることが示された．
次に，HIF-1が実際に抗アポトーシス作用を示すのかどうかを調べるために，HIF-1 alphaのsiRNAによるノックダウン及びHIF-1のDNA binding inhibitorであるEchinomycinを用いて，DMOGの抗アポトーシス作用への影響を調べた．HIF-1 alpha ノックダウン，またEchinomycinによる阻害はアポトーシスを増加させたことからHIF-1が抗アポトーシス作用を示すことが示された．一方でDMOGの抗アポトーシス作用はHIF-1阻害条件下においても示され，HIF-1 independentな効果をDMOGが持つことが示唆された．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通りIn vitroでのDMOGの抗アポトーシス効果を示すことが出来た．

Strategy for Future Research Activity

昨年度の実験を踏まえ1. DMOGの抗アポトーシス効果のメカニズムの検討，2.動物モデルにおけるDMOGの抗アポトーシス効果の検討の２つの面から実験を進める．
DMOGの抗アポトーシス効果メカニズムについてはFasL/Fas系のアポトーシスに関わる，Fas，FADD，FLIP，capase8及びcaspase3のタンパク量の変化についてWestern blottingもしくはフローサイトメトリーによって評価を行う．さらにこれらの背景に細胞代謝の変化がみられるか調べるために，ATPの定量を行うとともに2-デオキシ-d-グルコースの投与による解糖系阻害がどのような変化をもたらすのか検討する．
動物モデルにおいてはまず，FasLの経気管投与による肺傷害モデルを確立する．その上で，DMOGの全投与が肺のcaspase3やTUNNEL染色による肺胞上皮細胞のアポトーシスの定量に対してどのような影響をあたえるのか検討を行う．

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

物品発注や購入は極めて計画的に行っているが、最終的に端数が発生した。
次年度の物品購入の一部として使用する予定である。