2013 Fiscal Year Research-status Report
シダ植物小葉類の根の分枝様式と分枝メカニズムの解明
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25870088
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Japan Women's University |
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Principal Investigator |
藤浪 理恵子 日本女子大学, 理学部, 助教 (40580725)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 維管束植物 / シダ植物小葉類 / 形態進化 / 根 |
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| Research Abstract |
維管束植物は１本の軸が分枝する能力を獲得したことにより茎、葉、根の３器官が生じたと推定され、分枝は３器官の形態進化を明らかにする上で重要な特徴であると考えられる。本研究では、維管束植物の分子系統関係で最初に分岐し、根が茎と同様に外生分枝するシダ植物小葉類に着目して根の分枝様式を明らかにし、根の進化過程を推定する。
本年度は、根頂端分裂組織（RAM）の構造の異なる小葉類２科から、ヒカゲノカズラとトウゲシバ（ヒカゲノカズラ科）、コンテリクラマゴケ（イワヒバ科）を材料とし、RAMの構造と分枝形成時の細胞分裂動態についてEdU蛍光染色法を用いて解析を行った。３種のRAM構造は、ヒカゲノカズラが種子植物の開放型に類似する構造をもち、トウゲシバは頂端細胞群が層状に並び、コンテリクラマゴケは1つの頂端細胞をもつ形態を示す。EdU解析により、ヒカゲノカズラはRAM中央部に細胞分裂がほとんど行われない領域、すわなち種子植物の静止中心に相当する領域（QC様領域）の存在が明らかとなった。層状型のトウゲシバもヒカゲノカズラと同様にQC様領域の存在が確認された。一方、頂端細胞の構造をもつコンテリクラマゴケのRAMはQC様領域に相当する領域の存在は観察されなかった。したがって、小葉類のRAM構造は種子植物とシダ植物大葉類がもつRAM構造の違いに匹敵し、平行的に進化した可能性が推定される。
外生分枝の発生は、QC様領域をもつヒカゲノカズラを重点的に解析した。その結果、分枝初期のQC様領域は横方向に細胞数を増加させて領域を拡大し、その後、拡大したQC様領域内のほぼ中央部に数個の分裂細胞（IC：介在細胞群）が生じ、ICが増加することによって、QC様領域が二分されることが明らかとなった。したがって、ヒカゲノカズラの根の外生分枝は、QC様領域の拡大とICによるQC様領域の分断によって行われると示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
シダ植物小葉類の根の解析を行うため、野外で生態調査とEdU取り込み実験、遺伝子発現解析の植物試料採集を行った。本年度は、ヒカゲノカズラとトウゲシバ、コンテリクラマゴケの生育地である京都府清滝川周辺と東京都小石川植物園を主要な調査地とした。ヒカゲノカズラは京都府清滝川周辺にて調査を行い、生長解析とEdU、分子遺伝学的解析に必要な試料を得ることができた。コンテリクラマゴケは東京都小石川植物園にて栽培されている植物体を利用し、生長解析及びEdU解析用試料の準備を行い、次年度から分枝の発生段階を追った詳細な解析実験を行う予定である。トウゲシバは、京都府清滝川周辺と静岡県函南原生林にて採集調査を行い、次年度に他の２種と同様の解析実験を行う予定である。
小葉類３科の根の分枝様式については、ヒカゲノカズラを重点的に解析した。EdU取り込み後のヒカゲノカズラの根を4％PFA in 0.1Mリン酸Bufferで固定し、定法により樹脂切片を作成して蛍光顕微鏡観察および組織染色法による光学顕微鏡観察を行った。QC様領域の範囲とEdU取り込みの有無の細胞単位の解析を行い、分枝時にQC様領域内の細胞分裂頻度が上昇し、細胞数が増加することが明らかとなった。その後、QC様領域内のほぼ中央部に小型の細胞群が生じ、その細胞群の拡大によってQC様領域が２つに分断され、二又分枝が行われることが示唆された。
小葉類のRAM構造の維持と分枝に関わる遺伝子の単離を行うために、ヒカゲノカズラの根で発現する遺伝子をRNA-seq法による次世代シークエンサー解析により行った。その結果、WOX family遺伝子に相同な配列を取得できている。現在、相同遺伝子の単離を行い、RNA in situ hybridization法による発現解析の準備を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
シダ植物小葉類３科のRAM構造の解剖学的特徴とヒカゲノカズラのQC様領域の存在が明らかにされたことから、他の2タイプである層状型と頂端細胞型のQC様領域の有無について更なる検証が必要であると考える。そこで、層状型のトウゲシバと頂端細胞型のコンテリクラマゴケの根を用いて、EdU染色法による細胞分裂動態の解析を行う。EdU取り込み実験は京都府清滝川周辺と静岡県函南原生林、東京都小石川植物園にて4月から7月に実施し、蛍光顕微鏡観察と組織染色による光学顕微鏡観察を行う。また、ヒカゲノカズラのQC様領域が種子植物のQCと比較が可能であるかを検証するために、モデル植物などでQCに機能することが知られているWOX相同遺伝子の単離と発現解析を行う。ヒカゲノカズラの根で発現する相同遺伝子は、すでにRNA-Seq法による発現遺伝子の網羅的解析から配列を取得済みであり、現在遺伝子の単離を行っている段階である。
また、小葉類の根の分枝様式を明らかにするために、トウゲシバとコンテリクラマゴケを用いて、分枝の発生段階を追ったEdU染色法と組織染色法による解剖学的解析を行い、ヒカゲノカズラの分枝様式と比較を行う。さらに、外生的に分枝するという点で同じ特徴をもつ茎についても分枝様式を比較し、根との比較を行う。茎の分枝の解析は、ヒカゲノカズラの茎を用い、組織染色法による発生解剖学的解析と分枝に関与する遺伝子の発現解析を行い、根と茎の分枝様式の違いを比較し、小葉類の根と茎の進化過程の推定を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
小葉類３科の根頂端分裂組織の構造と分枝形成を明らかにするために、分子遺伝学的手法を取り入れ、根頂端分裂組織の構造維持に関与する遺伝子（WOX、KNOX、CLE）と分枝形成に関与する遺伝子群の単離を試みている。当初はdegenerate primerを用いたPCR法を行っていたが、次世代シークエンスサーによるRNA-Seq法を用いて根で発現する遺伝子の配列を網羅的に取得し、単離する方針へ転換した。今年度の段階では、根の分枝の発生段階を詳細に区別せずに行ったため、分枝時に機能する遺伝子の特定を行うことができていない。そこで、植物体の入手が可能な4月から7月にかけて新たに材料を野外で採集し、より詳細な解析を行う必要となったため、次年度使用額が生じた。
小葉類の根の構造維持と分枝形成に関与する遺伝子の発現解析を分枝形成メカニズムを明らかにするために行う。小葉類３科のうち、ヒカゲノカズラ、トウゲシバ、コンテリクラマゴケを材料とし、遺伝子の単離と遺伝子発現解析実験を行う。発現遺伝子の単離は、次世代シークエンスによるRNA-Seq法を行い、根の分枝発生段階ごとに発現する遺伝子を比較し、遺伝子の特定を行う。さらに同じ外生分枝の特徴をもつ茎の分枝との比較を行うため、茎も同様にRNA-Seq法により発現遺伝子の解析を行う。
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Research Products
(2 results)
