蛍光顕微鏡観察のための効率的な植物試料作成技術の確立と学生実習への応用

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25909060
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 山本 宏子 北海道大学, 理学研究院, 技術専門職員
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2014-03-31
• Keywords: 蛍光顕微鏡 / 学生実習 / アグロインフィルトレーション法

Research Abstract

1. 研究目的 : GFPに代表される蛍光タンパク質の発見などにより、蛍光顕微鏡を用いた生細胞内の分子イメージング法の発展がめざましく、学部教育においてもこれに対応した教育コンテンツの需要が高まってきている。北海道大学理学部生物学科では、LEDを光源とした蛍光正立顕微鏡45台が導入され、実習に参加する学生全員が個別に蛍光顕微鏡を使用できる環境が整備された。本研究では、植物を材料として、学生一人一人が実習用蛍光観察試料を作製するための新たな方法を確立し、これを用いて学生実習での効率的な実践を目的とする。
2. 研究方法 : アグロインフィルトレーション法を用い、タバコ葉へ蛍光タンパク質遺伝子を導入し、葉の細胞内で目的タンパク質を一過的に発現させた。目的遺伝子(A)とp19遺伝子(B)を組込んだ2種類のアグロバクテリウムを各5ml培養した。培養液2mlを遠心分離し、沈殿を回収した。沈殿に2mlのインフィルトレーションバッファー(IB)を加え懸濁した。各120μlのAおよびBの懸濁液と1560μlのIBを混合し、1.8μlのアセトシリンゴン溶液を加え転倒混和した。1mlの針なしシリンジを用いて混合液をタバコ葉へ注入した。2日間生育した後、葉を蛍光顕微鏡で観察した。目的遺伝子として、GFPおよび植物の栄養応答にかかわるATL31とGFPの融合タンパク質を過剰発現させる遺伝子を用いた。同様の方法を用いて、BiFC法による細胞内におけるATL31とその相互作用因子のタンパク質相互作用の観察を行った。これらの手法を、学部3年生を対象とした実習で実践した。実習時間内で実験を行うため、事前に遺伝子を導入したアグロバクテリウム培養液を学生の人数分用意した。
3. 研究成果 : 蛍光顕微鏡を用いた観察により、タバコ葉の細胞内におけるGFPの発現、ATL31の細胞内局在、およびタンパク質の相互作用が確認された。タバコ葉へ混合液を注入する際に失敗する学生もみられたため、改善方法の検討が必要である。